抑制CaMKⅡα对大鼠脑缺血再灌注氧化应激的影响及相关机制研究

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脑卒中是一种高发病率、高病死率、高复发率的重大突发疾病,我国的脑卒中现患人数高居世界首位,其中缺血性脑卒中约占70-80%。缺血性卒中的主要治疗目标是及时恢复血液供应,开通堵塞血管,实现缺血脑组织的血液再灌注。然而,突然恢复血液供应可能会导致更严重的伤害,即脑缺血再灌注损伤。在脑缺血再灌注期间,发生多种病理生理变化,如钙超载、自由基损伤等。钙超载时神经元内Ca2+浓度升高,Ca2+与钙调蛋白(CaM)结合后可激活各种Ca2+依赖的酶(如CaMKⅡ、一氧化氮合酶)。其中,Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是钙/钙调蛋白活化蛋白激酶家族的重要成员,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,CaMKⅡα是CaMKⅡ一个重要的亚型,主要在神经元中高度表达,在神经元死亡和存活的调控中发挥着重要作用。缺血性脑卒中发生后,脑组织缺血缺氧,ATP合成障碍,细胞内钙离子浓度增加,线粒体去极化,细胞中抗氧化保护机制不足,导致大量活性氧自由基(ROS)产生堆积,对细胞产生毒性,攻击机体,即为氧化应激。研究表明,缺血再灌注时,除了钙超载因素,ROS也可以直接激活CaMKⅡ,使其发生底物磷酸化和自身磷酸化并参与到氧化应激损伤。CaMKⅡ被激活后,磷酸化型CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)增多,为了恢复基础失活,需要通过蛋白磷酸酶的作用去除磷酸化,而蛋白磷酸酶本身也受到氧化应激的调控。氧化应激可通过多种途径参与激活CaMKⅡ,CaMKⅡ再以其磷酸化形式(p-CaMKⅡ)参与细胞损伤过程。在氧化应激过程,还原型谷胱甘肽(GSH)是机体内主要的抗氧化分子,起到非常重要的抗氧化作用,可防止、减轻自由基和过氧化物等活性氧引起的细胞损伤。而维持GSH还原状态主要靠还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平,磷酸无糖途径是产生NADPH的关键途径,葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)是磷酸戊糖途径的限速酶,其可介导NADPH的产生,通过维持GSH的还原状态,起到抗氧化作用。缺血再灌注时,活性氧堆积,致GSH、NADPH消耗增多,氧化应激加重,可触发G6PD表达代偿性升高,这对维持细胞内氧化还原状态的平衡发挥重要作用。氧化应激参与激活CaMKⅡ磷酸化,后以p-CaMKⅡ形式参与细胞损伤,有研究表明抑制CaMKⅡ可通过恢复氧化剂和抗氧化剂之间的平衡减轻氧化损伤,而G6PD表达水平对氧化应激有着非常重要的影响,二者都与氧化应激有着密切关系,所以我们推测CaMKⅡ α和G6PD在脑缺血再灌注氧化应激过程中可能存在相互作用,目前尚未有相关研究的报道。这给我们探索CaMKⅡ抑制剂在脑缺血再灌注中的作用机制提供一个方向。基于上述理论基础,本研究中,我们首先通过线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型实现脑缺血再灌注损伤,检测缺血再灌注后不同时间点氧化还原指标的变化和CaMKⅡα、p-CaMKⅡα、G6PD水平的变化以及p-CaMKⅡα和G6PD的表达分布。之后,体外建立神经元缺血再灌注-糖氧剥离(OGD)模型,通过CaMKⅡαsiRNA体外转染小鼠海马神经元细胞来抑制CaMK Ⅱ α表达,检测抑制CaMKⅡα表达对神经元缺血再灌注的影响和G6PD表达的变化。然后大鼠脑室内注射CaMKⅡαsiRNA转染复合物,构建大鼠MCAO模型,评估神经功能缺损评分和脑梗死体积,检测CaMKⅡα基因沉默效果、抑制CaMKⅡα后氧化还原指标和G6PD水平,分析抑制CaMKⅡα对脑缺血再灌注氧化应激的影响及G6PD表达的变化。最后,通过脑室内注射G6PD siRNA转染复合物,建立大鼠MCAO模型,检测氧化还原指标、CaMKⅡα表达变化,验证G6PD对氧化应激的影响及进一步探索G6PD与CaMKⅡα二者的关系。本研究旨在探索抑制CaMKⅡα对大鼠脑缺血再灌注氧化应激的影响及可能的机制,这为CaMKⅡ抑制剂在缺血性卒中临床治疗中的应用提供实验及理论参考。本课题包括以下四部分:1.大鼠大脑中动脉阻塞模型中氧化还原指标的变化及CaMKⅡα和G6PD的表达;2.体外转染CaMKⅡαsiRNA对神经元缺血再灌注的影响及CaMKⅡα和G6PD表达的变化;3.体内抑制CaMKⅡα对脑缺血再灌注氧化应激的影响及G6PD表达的变化;4.体内抑制G6PD对脑缺血再灌注氧化应激和CaMKⅡα的影响。第一部分 大鼠大脑中动脉阻塞模型中氧化还原指标的变化及CaMKⅡα和G6PD的表达方法:1.建立大鼠MCAO模型,根据缺血再灌注后不同时间点进行分组,将35只大鼠分为假手术组(n=5)、MCAO后3小时组(3h;n=5)、MCAO后6小时组(6h;n=5)、MCAO后 12 小时组(12h;n=5)、MCAO后 24 小时组(24h;n=10)和MCAO后 48 小时组(48h;n=5)。2.应用相应试剂盒检测缺血再灌注后不同时间点各组梗死侧大脑皮层以ROS含量、GSH/GSSG比值、NADPH/NADP+比值为代表的氧化还原指标。3.通过免疫荧光染色呈现脑缺血再灌注后p-CaMKⅡα和G6PD在梗死侧大脑表达的分布。采用Western Blot方法检测CaMKⅡα、p-CaMKⅡα和G6PD水平。分析比较脑缺血再灌注后氧化还原指标的变化趋势、CaMKⅡα和其磷酸化水平及G6PD水平的动态变化。结果:1.与假手术组比较,MCAO术后各组ROS含量明显升高(p<0.05),且随着缺血再灌注时间的延长呈进行性升高,而GSH/GSSG比值和NADPH/NADP+比值明显下降(p<0.05),随时间延长呈进行性下降,脑缺血再灌注后48小时内氧化和抗氧化失衡进行性加重。2.MCAO术后p-CaMKⅡα和G6PD都主要表达在大脑皮层的神经元和神经胶质细胞。3.与假手术组比较,MCAO术后各组CaMKⅡα表达水平无明显差异(p>0.05),p-CaMKⅡα和p-CaMKⅡα/CaMKⅡα水平明显升高(p<0.05),同时G6PD表达明显升高(p<0.05),且随时间延长逐渐升高。脑缺血再灌注后,氧化应激激活CaMKⅡα磷酸化增多,同时触发G6PD表达代偿性升高。第二部分 体外转染CaMKⅡαsiRNA对神经元缺血再灌注的影响及CaMKⅡα和G6PD表达的变化方法1.体外培养HT22小鼠海马神经元细胞,细胞培养第5天时采用免疫荧光细胞化学方法进行海马神经元纯度鉴定。2.设计合成siRNA,体外转染细胞时设计转染浓度梯度:10nM、50nM、100nM,转染24h后进行real-time PCR,确定最终转染浓度。3.细胞培养第4天体外转染CaMKⅡαsiRNA(相应Scramble siRNA做为阴性对照),第5天构建缺血再灌注-糖氧剥离(OGD)模型。分为4组:control组(空白对照组)、OGD组、OGD+阴性对照组、OGD+CaMKⅡαsiRNA组。以OGD模型换液复氧为起点,复氧后12h进行神经元凋亡坏死检测,复氧后0h、12h、24h、48h时间点应用Western blot检测CaMKⅡα、p-CaMKⅡα和G6PD蛋白水平,real-time PCR检测CaMKⅡαmRNA和 G6PDmRNA水平。结果1.免疫荧光细胞化学方法显示体外培养HT22小鼠海马神经元纯度较高;2.CaMKⅡαsiRNA体外转染海马神经元细胞时,随着转染浓度的增加,转染效率增加,50nM和100nM无明显差异,选取50nM为最终转染浓度;3.复氧后12h,OGD组神经元坏死比率明显高于control组(p<0.05),造模成功。与OGD+阴性对照组相比,OGD+CaMKⅡαsiRNA组神经元坏死比率明显降低(p<0.05),OGD+阴性对照组与OGD组相比无明显差异(p>0.05)。抑制CaMKⅡα表达对神经元缺血再灌注损伤有保护作用。4.复氧0h、12h、24h、48h后,OGD组和control组相比,CaMKⅡα表达水平没有明显差异(p>0.05),但CaMKⅡα磷酸化明显增加(p<0.05)。OGD+CaMKⅡαsiRNA组和OGD+阴性对照组相比,复氧 0h、12h、24h后CaMKⅡα表达明显降低(p<0.05),其磷酸化明显减少(p<0.05),复氧48h后CaMKⅡα表达及其磷酸化程度没有明显差异(p>0.05)。体外转染CaMKⅡαsiRNA短期内可抑制CaMKⅡα表达,减少其激活磷酸化。5.复氧12h、24h、48h后,OGD组和control组相比,G6PD表达水平明显升高(p<0.05),且随时间延长逐渐升高。OGD+CaMKⅡαsiRNA组和OGD+阴性对照组相比,复氧0h、12h、24h后G6PD表达水平明显升高(p<0.05),复氧48h后G6PD表达水平没有明显差异(p>0.05)。缺血再灌注后G6PD表达升高,抑制CaMKⅡα后可进一步上调G6PD表达。第三部分 体内抑制CaMKⅡα对脑缺血再灌注氧化应激的影响及G6PD表达的变化方法:1.首先通过侧脑室内注射CaMKⅡαsiRNA转染复合物(相应Scramble siRNA做为对照),建立大鼠MCAO模型。将40只大鼠随机分为假手术组(n=10)、MCAO组(n=10)、MCAO+Scramble siRNA组(Scr;n=10)、MCAO+CaMKⅡαsiRNA组(si-CaMKⅡα;n=10)。处死大鼠前进行神经功能缺损评分。处死大鼠后应用TTC染色计算梗死体积。2.用Western Blot方法检测CaMKⅡα和p-CaMKⅡα水平,采用real-time PCR检测梗死侧大脑皮层CaMKⅡαmRNA水平,确定CaMKⅡα基因沉默效果。3.应用相应试剂盒检测氧化还原指标,Western Blot和real-time PCR检测G6PD表达。分析比较各组神经功能缺损评分、脑梗死体积、氧化还原指标和G6PD表达的变化。结果:1.与Scr组相比,si-CaMKⅡα组CaMKⅡα表达水平明显下降(p<0.05)。脑室内注射CaMKⅡαsiRNA转染复合物可以抑制皮层CaMKⅡα的表达。2.与MCAO组和Scr组相比,si-CaMKⅡα组CaMKⅡα磷酸化明显减少(p<0.05),神经功能缺损评分明显降低(p<0.05),脑梗死体积明显缩小(p<0.05),ROS水平明显降低(p<0.05),GSH/GSSG比值和NADPH/NADP+比值明显升高(p<0.05),G6PD表达明显升高(p<0.05)。抑制CaMKⅡα表达后上调G6PD表达,改善缺血再灌注后氧化和抗氧化失衡,减少CaMKⅡα激活磷酸化,改善神经功能缺损,缩小梗死体积,起到神经保护作用。第四部分 体内抑制G6PD对脑缺血再灌注氧化应激和CaMKⅡα的影响方法:1.为了验证G6PD对氧化应激的影响及进一步探索G6PD与CaMKⅡα二者的关系,我们采用抑制CaMKⅡα表达的方法进行G6PD表达的抑制。首先通过侧脑室内注射G6PD siRNA转染复合物(相应Scramble siRNA做为对照),然后建立大鼠MCAO模型。将20只大鼠随机分为假手术组(n=5),MCAO组(n=5)、MCAO+Scramble siRNA组(Scr;n=5)、MCAO+G6PD siRNA组(si-G6PD;n=5)。2.采用Western Blot方法检测G6PD蛋白表达水平,real-time PCR检测梗死侧大脑皮层G6PD mRNA水平来确定G6PD基因沉默效果。3.应用试剂盒检测氧化还原指标,Western Blot方法检测CaMKⅡα、p-CaMKⅡα水平,real-time PCR检测CaMKⅡαmRNA水平。分析比较各组氧化还原指标和CaMKⅡα及其磷酸化变化。结果:1.与Scr组相比,si-G6PD组G6PD表达明显下降(p<0.05),脑室内注射G6PD siRNA转染复合物可以抑制皮层G6PD的表达。2.与MCAO组和Scr组相比,si-G6PD组ROS水平明显升高(p<0.05),GSH/GSSG比值和NADPH/NADP+比值明显降低(p<0.05),CaMKⅡα表达无明显差异(p>0.05),但其磷酸化明显增多(p<0.05)。抑制G6PD表达后加重氧化和抗氧化失衡,增加CaMKⅡα激活磷酸化。结论:1.脑缺血再灌注48小时内氧化应激呈进行性加重,CaMKⅡα被激活磷酸化增多,同时氧化应激触发G6PD表达代偿性升高。2.神经元缺血再灌注后CaMKⅡα表达无明显变化,但其激活磷酸化增多,应用特异性针对小鼠CaMKⅡα基因设计的siRNA进行体外转染,短期内可抑制CaMKⅡα表达,减少其激活磷酸化,对神经元缺血再灌注损伤有保护作用。3.神经元缺血再灌注后G6PD表达增高,且随时间延长呈逐渐增高趋势,抑制CaMKⅡα可明显上调G6PD表达,而其升高程度明显高于缺血再灌注后G6PD表达的增高。4.G6PD参与氧化应激,抑制G6PD表达可加重脑缺血再灌注后氧化应激,增加CaMKⅡα激活磷酸化,加重神经损伤。而抑制CaMKⅡα表达后通过上调G6PD表达减轻氧化应激,减少CaMKⅡα激活磷酸化,减轻神经损伤,有明显神经保护作用。
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