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磷是植物生长必需的大量元素之一,在植物的整个生命活动中发挥着重要的作用,广泛参与植物体内的生化合成、能量转移、信号转导等代谢过程。植物通过根系吸收无机磷（Pi）,然后把Pi运输到植物地上的各个部位,使植物能够正常生长。杨树（Populus）是我国营建速生丰产林和生态防护林的重要树种之一,具有无性繁殖容易、生长迅速、用途广泛等特点。解析杨树体内Pi调控的分子机理,对于我国的木材生产和生态环境建设具有重要意义。WRKY基因家族编码一类重要的转录因子,是植物中最重要的蛋白家族之一。PHT1家族主要在Pi的吸收与转运过程中发挥着重要的作用。前期研究发现,杨树WRKY65可能参与了Pi含量的调控。本研究通过已经创建的超表达WRKY65（OE-WRKY65）和抑制表达WRKY65（RE-WRKY65）转基因材料开展Pi含量调控相关的研究,筛选并验证以WRKY65为中心的转录因子WRKY6及PHT1家族成员PHT1;9共同参与对杨树Pi运输的调控。主要研究结果如下。1.杨树野生型（WT）在低Pi条件下,WRKY65的表达被明显抑制。OE-WRKY65转基因材料在正常和低Pi条件下顶芽较WT更红,这些结果暗示杨树WRKY65可能参与低Pi响应。通过对杨树根和顶芽中Pi含量进行精细测定,在正常Pi条件下,与WT相比,OE-WRKY65根中Pi含量显著增加（P＜0.05）,顶芽Pi含量显著减少（P＜0.05）;RE-WRKY65中Pi含量与OE-WRKY65相反（P＜0.05）。在低Pi条件下,OE-WRKY65根中Pi含量显著减少（P＜0.05）,顶芽中Pi含量显著减少（P＜0.05）;RE-WRKY65根中Pi含量显著减少（P＜0.05）,顶芽中Pi含量显著增加（P＜0.05）。此外,在异源超表达杨树WRKY65的拟南芥转基因株系中,根中Pi含量较拟南芥WT显著增加（P＜0.05）,顶芽Pi含量显著减少（P＜0.05）,表现出与杨树OE-WRKY65相同的Pi含量趋势。这些结果进一步确认WRKY65参与杨树低Pi响应,并且负调控Pi的运输。2.对OE-WRKY65转基因株系进行RNA-Seq分析,发现Pi运输相关基因PHT1;9被明显抑制。qRT-PCR结果显示,PHT1;9在OE-WRKY65转基因材料中表达量下降,在RE-WRKY65转基因株系中表达量上调,与RNA-Seq结果高度相符。同时,PHT1;9在低Pi条件下表达量上调,表明PHT1;9也参与杨树低Pi响应。通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）、酵母单杂交（Y1H）、染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）和烟草瞬时共表达实验,证明杨树WRKY65能结合PHT1;9启动子并抑制其表达。这些结果表明,杨树WRKY65可能是通过结合PHT1;9启动子而抑制其表达,进而参与杨树Pi运输调控。3.创建超表达PHT1;9（OE-PHT1;9）和抑制表达PHT1;9（RE-PHT1;9）转基因材料。在正常Pi条件下,与WT相比,OE-PHT1;9根中Pi含量显著降低（P＜0.05）,顶芽中Pi含量显著增加（P＜0.05）,RE-PHT1;9中Pi含量则呈相反趋势;在低Pi条件下,OE-PHT1;9根中和顶芽Pi含量均显著增加（P＜0.05）,而RE-PHT1;9根中Pi含量显著增加（P＜0.05）,顶芽中Pi含量显著降低（P＜0.05）。这一结果表明PHT1;9在杨树参与调控Pi的运输。4.OE-WRKY65进行RNA-Seq分析时,筛选出另一表达量上调基因WRKY6。与WRKY65不同,WRKY6低Pi条件下表达量上调。创建超表达WRKY6（OE-WRKY6）和抑制表达WRKY6（RE-WRKY6）转基因材料。与WT相比,在正常Pi条件下,OE-WRKY6根中Pi含量显著减少（P＜0.05）,顶芽中Pi含量显著增加（P＜0.05）,RE-WRKY6呈相反趋势（P＜0.05）;在低Pi条件下,OE-WRKY6根和顶芽中Pi含量均显著增加（P＜0.05）,RE-WRKY6转基因株系根和顶芽Pi含量均显著减少（P＜0.05）。以上结果均证明WRKY6也参与杨树低Pi胁迫响应,并参与正调控杨树体内Pi的运输。通过qRT-PCR结果分析,发现OE-WRKY6中PHT1;9的表达量上调,RE-WRKY6中PHT1;9的表达量下调。同时通过烟草叶片瞬时转化实验、染色质免疫共沉淀实验（ChIP-qPCR）和凝胶迁移阻滞实验（EMSA）以及酵母单杂交（Y1H）,证明了WRKY6通过促进PHT1;9的表达正向调控植物对Pi的运输。此外,通过酵母双杂交（Y2H）,发现WRKY65和WRKY6不存在蛋白水平的互作。并且qRT-PCR结果分析和烟草叶片瞬时表达等实验,证实了WRKY65与WRKY6不存在上下游的调控关系。5.基于本研究的结果,我们提出了在杨树中WRKY65、WRKY6和PHT1;9共同参与Pi从根到顶芽运输的调控模型:在低Pi条件下,杨树WRKY65的表达受到抑制,同时可以特异性结合PHT1;9启动子,抑制PHT1;9的表达,负调控Pi的运输;而杨树WRKY6表达受低Pi诱导上升,同时结合PHT1;9启动子,促进PHT1;9的表达,正调控Pi的运输。WRKY65和WRKY6转录因子分别通过独立地调控PHT1;9的表达,二者之间不相互作用,进而调控杨树体内Pi的运输,维持杨树体内Pi的稳态。通过本研究的开展,我们在植物中揭示了一条新的Pi运输调控的分子网络。该研究解析了杨树通过这种双层调控,控制Pi从根到顶芽的运输,保证体内Pi的动态平衡的机制,对解析杨树中Pi调控的分子机理具有重要的生物学意义。