【摘 要】
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目的:本课题通过昆虫杆状病毒系统构建柯萨奇病毒B组5型（Coxsackiecirus,CB5）病毒样颗粒疫苗。方法:1.将优化合成后的CB5 P1（前体蛋白）和3CD（编码病毒蛋白酶）基因插入质粒pOET5,获得重组质粒pOET5-P1-3CD,通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统（flash BAC）表达含有CB5 P1和3CD基因的重组杆状病毒,并感染sf9昆虫细胞,表达CB5病毒样颗粒（Virus
【基金项目】
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国家自然科学基金资助课题（81660280）； 广西研究生教育创新计划项目（YCSW2019211）；
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目的:本课题通过昆虫杆状病毒系统构建柯萨奇病毒B组5型（Coxsackiecirus,CB5）病毒样颗粒疫苗。方法:1.将优化合成后的CB5 P1（前体蛋白）和3CD（编码病毒蛋白酶）基因插入质粒pOET5,获得重组质粒pOET5-P1-3CD,通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统（flash BAC）表达含有CB5 P1和3CD基因的重组杆状病毒,并感染sf9昆虫细胞,表达CB5病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）,以Western Blot鉴定衣壳蛋白的表达,通过聚乙二醇沉淀法浓缩释放到细胞培养上清的CB5 VLPs,采用蔗糖梯度离心的方法纯化该浓缩液,以透射电镜观察VLPs的形态。2.6周龄BALB/c雌性小鼠每组6只,共4组;CB5 VLPs疫苗为实验组,CB5灭活疫苗为阳性对照,野生型杆状病毒为阴性对照,PBS为空白对照;辅以完全/不完全弗氏佐剂;分别对每只小鼠以10μg/次的剂量进行腹腔接种,Week0、Week2和Week4分别免疫一次,每次免疫前采集血清,分别于Week6和Week12从尾部取血,ELISA测定各组小鼠血清特异性IgG抗体水平,微量中和实验检测小鼠血清中针对CB5的中和抗体效价。3.6周龄ICR雌性小鼠每组2只,共4组;分组及免疫接种途径和剂量同方法2。分别对每只小鼠以10μg/0.1 ml的剂量进行皮下接种,Week0、Week2和Week4分别免疫一次。于Week3使母鼠交配,约Week6～7时分娩新生乳鼠,以10只1日龄乳鼠为一组;各组分别以50倍LD50的CB5鼠适应株颅内感染,持续观察15天并记录乳鼠存活率以及临床症状。结果:1.以灭活CB5全病毒免疫小鼠抗血清作为一抗,HRP标记羊抗小鼠IgG抗体为二抗,通过Western blot对sf9昆虫细胞的蛋白表达进行验证,在36 k Da和28 k Da处均出现目的带,分别为VP1和VP3;透射电子显微镜下可观察到纯化的CB5 VLPs颗粒的形态与灭活CB5病毒颗粒的相似,其直径约为30 nm。2.ELISA结果显示,CB5 VLPs疫苗和CB5灭活疫苗免疫小鼠血清中均可检测到特异性IgG抗体,且其变化趋势相同:在第二次加强免疫后第2周,IgG抗体水平明显升高且达到高峰,之后抗体尽管有轻微下降,但仍持续较高水平。CB5 VLPs疫苗和CB5灭活疫苗免疫小鼠血清中IgG抗体水平明显增高（p＜0.05）。微量中和实验结果显示,CB5 VLPs疫苗组小鼠血清针对CB5的平均中和抗体效价为1∶160,CB5灭活疫苗组小鼠血清针对CB5的平均中和抗体效价为1∶128,相对于阴性对照组和PBS组,CB5VLPs疫苗和CB5灭活疫苗免疫小鼠血清的中和作用明显增强（p＜0.05）。3.小鼠攻毒保护实验结果显示,CB5 VLPs免疫的母鼠所生小鼠被完全保护,CB5灭活病毒免疫的母鼠所生小鼠被部分保护,其最终生存率分别为100%和80%。结论:本研究使用昆虫杆状病毒系统成功构建表达CB5 VLPs作为候选疫苗,该候选疫苗可诱导小鼠产生特异性IgG抗体,且能在体外赋予RD细胞针对CB5病毒的保护作用,在体内赋予新生小鼠针对CB5病毒的有效保护力,为研发CB5疫苗奠定理论基础和应用基础。
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