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羊传染性脓疱皮炎又称“羊口疮”,是由羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起的一种急性、接触性、嗜上皮性传染病,不但造成严重的经济损失,还威胁着人类健康。蛋白质CGI-55,又被称为SERBP1蛋白,其过表达可抑制由内质网压力引起的细胞凋亡。酵母双杂交结果显示,SERBP1与ORFV125存在相互作用,且ORFV125具有抑制细胞凋亡的作用。本课题组前期研究发现ORFV可诱导山羊鼻甲骨原代细胞的凋亡,SERBP1蛋白在ORFV诱导的细胞凋亡的机制尚不清楚。本研究克隆山羊SERBP1基因CDS区基础上,通过过表达或敲低SERBP1基因表达。初步验证SERBP1蛋白对细胞凋亡及其相关基因表达的影响;同时,在过表达、敲低SERBP1基因的基础上,研究SERBP1蛋白在ORFV诱导山羊鼻甲骨原代细胞凋亡中的作用,为进一步研究SERBP1蛋白在介导ORFV抑制宿主细胞凋亡的机制奠定基础。研究结果如下:一、山羊SERBP1基因CDS区克隆及真核表达载体构建根据GenBank中山羊SERBP1基因预测序列（XM＿018045378.1）设计特异性引物,以山羊脾脏c DNA为模板,扩增SERBP1基因CDS区,经测序鉴定并进行序列分析。同时将SERBP1基因的CDS区克隆至pcDNA3.1（+）载体,构建真核表达载体。结果成功扩增山羊SERBP1基因1293 bp,包含5’UTR 44 bp,CDS区1179 bp,3’UTR 70 bp,编码392个氨基酸残基;并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（+）-SERBP1。生物信息学分析显示该蛋白为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽,无跨膜结构域。该蛋白主要定位于细胞核,包含两种磷酸化位点,预测到SERBP1与宿主RPL31、RPS3等10个蛋白可能存在相互作用。二、山羊SERBP1基因过表达对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、周期、凋亡及其凋亡相关基因的影响1、山羊鼻甲骨原代细胞培养及SERBP1蛋白在细胞中的表达采集刚出生未哺乳健康山羊的鼻甲骨,分别采用1.3 mg/m L胶原酶I、1.3mg/m L胶原酶IV、0.125%胰蛋白酶消化法及组织块法分离培养山羊鼻甲骨原代细胞。结果显示,相较于酶消化法,组织块法获得的细胞数量较多,纯度高,细胞增殖能力好,可连续传至70代以上。将pcDNA3.1（+）-SERBP1转染山羊鼻甲骨原代细胞,Western Blot证明SERBP1蛋白在山羊鼻甲骨原代细胞中正确表达,与预期结果一致。2、过表达SERBP1基因对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、周期、凋亡及其凋亡相关基因的影响将pcDNA3.1（+）-SERBP1和pcDNA3.1（+）载体分别转染山羊鼻甲骨原代细胞48 h后,MTT法检测过表达SERBP1对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测过表达对细胞周期及凋亡的影响。结果显示,过表达SERBP1基因后可促进细胞的增殖和凋亡,细胞被阻滞于G2/M期;同时可上调Caspase3、Caspase7、P53和PARP1基因mRNA水平的表达。三、山羊SERBP1基因敲低对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、周期、凋亡及其凋亡相关基因的影响1、干扰siRNA片段的合成根据SERBP1基因序列设计合成3条siRNA干扰片段,3条siRNA干扰片段分别转染山羊鼻甲骨原代细胞48 h后,RT-q PCR检测结果显示,SERBP1-siRNA1对SERBP1的干扰效果最好,可降低SERBP1基因mRNA表达水平达70%。2、敲低SERBP1基因对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、周期、凋亡及其凋亡相关基因的影响将SERBP1-siRNA1和Negative Control分别转染山羊鼻甲骨原代细胞48 h后,MTT法检测敲低SERBP1对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测敲低SERBP1对细胞周期及凋亡的影响。结果显示,敲低SERBP1基因抑制了细胞的增殖和凋亡,且细胞被阻滞于G0/G1期;同时可下调Caspase3、Caspase7、BCL2L11和Bax基因mRNA的表达。四、SERBP1蛋白在ORFV诱导山羊鼻甲骨原代细胞凋亡中的作用研究流式细胞仪检测100 TCID50ORFV感染山羊鼻甲骨原代细胞后对细胞凋亡的影响,结果显示ORFV可诱导山羊鼻甲骨原代细胞凋亡。RT-q PCR方法检测ORFV感染不同时间点（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h）山羊鼻甲骨原代细胞中SERBP1基因的表达情况,结果显示ORFV可促进SERBP1基因表达,在48 h时表达量最高。为进一步分析SERBP1在ORFV感染过程中的作用,将ORFV分别感染过表达及敲低SERBP1的山羊鼻甲骨原代细胞,检测其对ORFV诱导细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响,敲低SERBP1基因后可抑制ORFV感染的细胞凋亡,导致细胞内促凋亡基因Caspase3和Caspase7 mRNA表达下降,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达上升;过表达SERBP1基因后可促进ORFV感染细胞的凋亡,导致细胞内Caspase7 mRNA表达上升,Bcl-2 mRNA表达下降。