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目的:通过建立慢性压迫性神经损伤(chronic constriction injury,CCI)大鼠疼痛模型,观察京尼平苷治疗病理性神经疼痛的作用,探讨京尼平苷的作用机制,为临床用药提供依据。方法:(1)初步实验 使用SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,体重250~300 g。通过结扎坐骨神经的方法,构建慢性压迫性神经损伤(CCI)的大鼠模型。造模成功为术后5~7天,大鼠随机分为模型组、京尼平苷组、健康大鼠对照组。京尼平苷组从分组这天起给予京尼平苷10mg/kg,每周给药6次,持续3周。以机械刺激缩足反射阈值(paw withdraw threshold,PWT)和热缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)为行为学测试指标,观察经京尼平苷治疗后CCI大鼠PWT和PWL值的变化。杀鼠后取各组大鼠L4~L5脊髓节段和坐骨神经组织进行转录组分析。(2)网络药理学和转录组分析利用治疗靶点疾病数据库如人类基因数据库(the human gene database,GeneCards)、疗效药靶数据库(Therapeutic Target Database,TTD)筛选病理性神经疼痛的相关疾病靶点,将分数值“Score”设置为>60分,获取与CCI相关的疾病靶点,同时利用Uni Prot(UniProt Knowledgebase)知识库核对靶点信息,筛选并进行整理,进而获得药物与疾病交集靶点,筛选出表皮生长因子受体(epidermal growth factor recep-EGFR)相关通路为主要靶点。使用Pymol软件分析,京尼平苷分子与EGFR蛋白进行分子对接;结合转录组测序结果对正常组、模型组及京尼平苷组大鼠的脊髓节段和坐骨神经组织进行基因本体(gene oncology,GO)分析和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。(3)动物实验为了验证京尼平苷对CCI的治疗通路,进行进一步的动物实验。继续通过结扎坐骨神经的方法,构建CCI的大鼠模型,造模成功为术后5~7天,大鼠随机分为模型组、阳性对照组(加巴喷丁,Ca2+拮抗剂,目前用于神经性疼痛的一线用药)、京尼平苷组、京尼平苷+EGFR激动剂组,并设置伪手术组和健康大鼠对照组。从这天起开始给药,每周给药6次,持续3周,以PWT和PWL值为行为学测试指标,观察经京尼平苷治疗后CCI大鼠PWT和PWL值的变化,以及加用EGFR激动剂后,大鼠行为学的变化。杀鼠后取各组大鼠L4~L5脊髓节段和坐骨神经组织,HE染色观察病理切片,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,ELISA检测炎性细胞含量。最后根据网络药理和转录组分析筛选出的通路,用免疫组织化学和蛋白印迹检测组织中相关通路中对应蛋白的表达水平及其磷酸化水平,并进行定量分析。结果:(1)初步实验 显示京尼平苷组可明显改善CCI大鼠PWT和PWL值。(2)网络药理学和转录组分析 药物与疾病交集靶点,筛选出表皮生长因子受体为京尼平苷治疗CCI的主要靶点,把京尼平苷分子与EGFR蛋白分子进行对接研究,并用Pymol软件进行分析,揭示了京尼平苷分子与EGFR蛋白分子的氢键对接潜力;结合转录组测序结果基因本体GO分析和KEGG富集分析,显示京尼平苷治疗CCI大鼠主要是通过调节信号转导、免疫系统、Ca2+通道和PI3K/AKT信号通路实现的。(3)动物实验:1.行为学 CCI造模后5~7天,模型组PWT和PWL值均显著降低,伪手术组与对照组无显著差异,说明CCI模型构建成功。从这天起每周给药6次,持续给药3周,发现京尼平苷组和加巴喷丁组在第21天和第28天的PWT和PWL值显著增加,显示京尼平苷确实具有疼痛缓解作用,可明显改善CCI大鼠PWT和PWL值。京尼平苷+EGFR激动剂组,因为EGFR激动剂的添加,京尼平苷的疗效显著逆转,表明京尼平苷可能抑制EGFR通路来改善CCI大鼠的PWT和PWL值。2.HE染色病理切片可见大鼠CCI模型组纵切面神经束排列紊乱,横切面大面积坏死,大量炎性细胞浸润。京尼平苷治疗后神经束排列较模型组明显改善,炎症细胞渗透减少。相反,在加入EGFR激动剂后再次观察到严重的神经损伤。3.TUNEL染色用于检测CCI大鼠神经元细胞凋亡早期细胞核DNA的断裂情况,TUNEL定量显示了京尼平苷的治疗有效且显著。在暴露于EGFR激动剂后表现了逆转现象,表明了 EFFR激动剂诱导CCI大鼠脊髓神经元细胞凋亡。4.ELISA检测 检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。炎症因子的表达CCI模型组显著高于正常对照组,而京尼平苷组CCI大鼠炎症因子表达显著降低,而添加了 EGFR激动剂的京尼平苷组炎症因子表达明显。5.IHC和WB对组织中p53、p38和EGFR的表达水平进行检测,同时用蛋白免疫印迹检测组织中 EGFR/PI3K/AKT 通路相关的 ERK、p38、EGFR、IκB、p50、NF-κB、p65、PI3K、AKT等蛋白表达水平及其磷酸化水平,进行定量分析,以此来确定京尼平苷在CCI中影响EGFR/PI3K/AKT通路的表达。另外我们通过蛋白质印迹检测了 Ca2+离子通道相关蛋白的表达。结果表明,京尼平苷不仅显著降低了 CCI大鼠神经中PKC的表达,也下调CCI大鼠神经中CaM、CaM KIIα和CaM KIIδ蛋白的表达。结论:(1)通过转录组数据及分子模拟对接技术对京尼平苷治疗CCI后的基因全局调控进行分析,表明京尼平苷可能通过EGFR/PI3K/AKT通路和Ca2+通道发挥抗炎调控作用。(2)确定了京尼平苷对CCI诱导的大鼠病理性神经疼痛治疗作用。通过添加EGFR激动剂验证京尼平苷通过调控EGFR/PI3K/AKT通路抑制炎症反应,发挥抗炎镇痛作用。免疫组织化学和蛋白质印迹也证明了京尼平苷抑制CCI大鼠EGFR/PI3K/AKT通路和Ca2+通道的激活;(3)京尼平苷作为安全可靠的慢性疼痛治疗备选药物,为京尼平苷在临床治疗病理性神经疼痛上的应用奠定基础。