背景:生物钟是生物体对地球自转和公转引起的光照、温度等环境因子的周期性变化的长期适应,从而产生内在的自发的计时机制。生物钟系统由输入通路、中央起搏器或振荡器和输出通路组成。输入通路用于接受外界光和温度等环境信号并传入核心振荡器,使得生物钟与环境同步,中央起搏器通过转录翻译以及修饰产生分子振荡,而输出通路则通过分子振荡调控生物下游生理和行为的节律变化。生物钟普遍存在于生物界从人类到蓝藻的各种物种以及从生物体到组织、细胞的各种生物层次,体外培养细胞和组织虽然脱离了生物体中枢神经的调控,也具备三大生物钟原件。果蝇生物钟的分子调控机制一直是研究热点,但人们对其他非果蝇昆虫的时钟机制鲜有研究。蚊是一类重要的医学媒介昆虫,可以传播疟疾、登革热、寨卡病毒病、丝虫病、黄热病、流行性乙型脑炎等多种疾病,对人类的生命健康造成极大的危害,不同蚊种根据它们自身的生态位,进化出了不同的昼夜节律行为,许多蚊虫的行为随着一天中的时间而改变,包括飞行活动、交配、产卵和叮咬等行为,而交配活动作为蚊虫羽化后生殖繁衍的重要生理行为,阐明蚊虫生物钟对交配节律的调控机制对于蚊媒防控具有非常重要指导意义。目的:1.探索白纹伊蚊C6/36细胞中是否存在昼夜节律,对细胞中节律振荡的核心时钟基因和非时钟基因进行特征分析和功能研究,阐明白纹伊蚊细胞水平的生物钟调控机制。2.观察白天活动的白纹伊蚊和夜晚活动为主的致倦库蚊在昼夜条件下的交配行为规律,探究核心时钟基因对两种蚊虫交配行为的作用和调控机制,为蚊虫的精准监测和防制提供理论基础。方法:1.建立白纹伊蚊C6/36细胞昼夜节律模型,在白昼和黑夜（12h Light:12h Dark,LD）条件下同步一周后,于光照开始时收集并每隔6h收集一次,一共收取24小时内5个时间点的细胞样本进行转录组测序,分析并验证转录组测序数据,对振荡基因进行特征分析。2.在白纹伊蚊C6/36细胞中用RNAi的技术手段敲低振荡表达的per基因,在敲低效率最高的第二天收集不同时间点的细胞样本,用RT-qPCR方法分析时钟基因per对细胞代谢基因节律表达的影响。3.分别将白纹伊蚊和致倦库蚊置于LD（8:00开灯,12h Light:12h Dark）、LDDD（12h Dark:121h Dark）、DL（20:00 开灯,12h Dark:12h Light）和 DLDD 等不同光照条件下,解剖各个时间段雌蚊的受精囊,计算雌蚊的授精率,比较两种蚊虫24h内的交配行为节律。4.用RT-qPCR检测LD条件下白纹伊蚊和致倦库蚊雌雄蚊头部和身体desat1基因在24小时内的时间表达谱,用dsRNA敲低desat1基因研究该基因对两种蚊虫交配行为的影响,并用气相色谱/质谱定量分析desat1基因干扰前后表皮碳氢化合物含量的变化。5.利用本实验室构建保种的per和clk白纹伊蚊和致倦库蚊敲除品系进行交配节律的比较,探索核心时钟基因对交配节律的调控作用和机制。结果:1.在白纹伊蚊C6/36细胞昼夜节律模型下,对不同时间点采集样本进行测序并筛选呈节律振荡的基因,结果发现除了核心时钟基因per呈现昼夜振荡表达外,其他核心时钟基因均没有呈现振荡;除核心时钟基因外,另外尚筛选到许多非核心时钟基因呈现振荡表达,这些基因主要参与代谢节律。2.在C6/36细胞中用siRNA干扰的方法敲低per后,per基因在一天内的表达趋于平缓,节律消失,另外发现参与糖酵解途径的三个关键限速酶基因烯醇化酶eno、乳酸脱氢酶imp3L、甘油醛3磷酸脱氢酶2（gapdh2）的振荡节律表现出不同程度的紊乱。3.白纹伊蚊和致倦库蚊在LD、LDDD、DL和DLDD条件下的交配行为均呈现昼夜节律,白纹伊蚊在24h内都可以交配,但在开灯后3h（清晨）和关灯前3h（傍晚）有两个交配高峰,交配率高达90%;致倦库蚊在一天24h内仅在关灯后3h呈现交配高峰,3h内的交配率最高为40%,在光照下几乎没有交配。4.desat1基因的时间表达谱结果显示在两种蚊虫中都呈现节律表达,白纹伊蚊desat1在白天和夜间都出现了表达高峰,而致倦库蚊desat1在光照向黑暗转换时间段有表达高峰;敲低雄蚊desat1基因会导致两种蚊虫的交配率显著下降,相比白纹伊蚊和致倦库蚊对照组90%左右的交配率,将desat1敲低后,白纹伊蚊交配率（65.5%）和致倦库蚊交配率（62.9%）均显著下降;desat1敲低后白纹伊蚊C19、C23、C29和C31表皮碳氢化合物水平下降,而C27升高;在致倦库蚊,C21、C23显著降低,C27、C29的则显著升高。5.白纹伊蚊时钟基因per、clk突变品系和致倦库蚊clk突变品系的交配节律均发生了不同程度的改变,白纹伊蚊perΔ207突变品系各个时间点交配率显著下降,各时间点的交配率范围是（0～40%）;白纹伊蚊clkΔ61突变品系各个时间点的交配率低于WT对照组,但是交配节律无明显改变,白纹伊蚊clkΔ293突变品系交配节律的峰值发生相位延迟,交配高峰延迟3h。致倦库蚊突变品系clkΔ98在白天各时间段均有交配,交配率为5～10%,夜间各时间点没有交配,与WT致倦库蚊的交配节律相反。另外突变品系的白纹伊蚊和致倦库蚊desat1基因的表达谱的振幅和相位都发生了不同程度的变化。结论:1.白纹伊蚊C6/36细胞核心时钟基因和非核心时钟基因都有呈现节律振荡表达,核心时钟基因中仅有per呈现节律振荡表达,说明白纹伊蚊C6/36细胞可能有不同于典型核心时钟基因振荡器的时钟机制;非核心时钟基因主要参与代谢节律。提示C6/36细胞可能存在不依赖于典型核心时钟基因振荡器来调节自身的代谢节律。2.在C6/36细胞中siRNA干扰的方法敲低per后,发现参与糖酵解途径的三个关键限速酶基因节律表现出不同程度的紊乱,提示per参与调控C6/36细胞中的代谢节律。3.白纹伊蚊和致倦库蚊存在完全不同的交配节律,白纹伊蚊主要在白天交配,且有两个交配高峰,致倦库蚊主要在黑暗后3h交配,仅有一个交配高峰。4.desat1基因的表达与交配活动密切相关,抑制desat1基因的表达会导致蚊虫的授精率显著下降。desat1敲低以后表皮碳氢化合物含量发生变化以及表皮碳氢化合物对交配的影响说明,desat1可以通过调节两种蚊虫表皮碳氢化合物的合成并影响交配活动。白纹伊蚊和致倦库蚊desat1基因的时间表达差异可能是两种蚊虫交配活动节律不同的原因之一。5.白纹伊蚊per、clk突变蚊虫和致倦库蚊clk突变蚊虫的交配节律发生变化,说明核心时钟基因参与调控了白纹伊蚊和致倦库蚊的交配节律,对白纹伊蚊和致倦库蚊突变品系desat1的表达谱验证的结果说明了核心时钟基因参与调控desat1基因的节律性振荡。