哺乳动物暴露于急性缺氧环境中可导致肺动脉血管发生收缩,而长期处于低氧环境中则会诱发肺动脉血管发生重塑,最终形成不可逆转的肺动脉高压。牦牛（Bos grunniens）作为长期生活在青藏高原等高海拔地区（海拔3000～5500米）的代表性动物,其肺脏经过长期的适应性并未表现出明显的血管重塑等症状,故牦牛是研究低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）防治的理想模型。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是生物体氧平衡调节和低氧适应性中的关键转录因子,能够调节100多种靶基因的表达从而使机体与组织细胞适应外周环境氧浓度的变化。因此,本研究以不同年龄段的牦牛为研究对象,选取黄牛为常氧对照组,分析HIF-1α在肺脏中的分布和表达情况,并通过转录组学和蛋白质组学等技术手段进一步研究低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞增殖的分子调控机制,具体结果如下:1.通过免疫组织化学、免疫组织荧光和Western blot等方法对HIF-1α在成年黄牛和牦牛肺脏中的分布和表达情况进行检测。结果显示,在成年黄牛肺脏中,HIF-1α主要表达于微动脉和部分肺泡细胞中;而在成年牦牛肺脏中HIF-1α则主要表达于肺动脉平滑肌细胞、细支气管上皮细胞和部分肺泡细胞中;此外,Western blot结果表明HIF-1α蛋白在成年牦牛肺脏中的表达量要高于黄牛,且有显著差异（p＜0.01）。随后,进一步检测了HIF-1α在不同年龄段牦牛肺脏中表达的和分布情况,并选取平滑肌细胞的标志因子α-SMA与HIF-1α进行了免疫荧光共定位。结果表明,随着牦牛年龄的增加,HIF-1α表达量逐渐升高,且成年和老年牦牛中HIF-1α主要定位于牦牛肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）中,说明其在牦牛肺动脉血管低氧适应性中发挥了重要作用。2.成功分离培养出原代牦牛肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,可见原代细胞呈“纺锤形”,并表现出平滑肌细胞典型的“峰-谷”状形态特征;采用差时贴壁法纯化原代细胞,细胞免疫荧光鉴定发现平滑肌细胞标志物α-SMA和Calponin-1呈阳性表达。将纯化后的PASMCs分别置于5%O2（低氧组）和21%O2（常氧组）条件下培养,通过CCK-8试剂盒和PCNA蛋白表达情况来判定细胞增殖的活力,结果表明,低氧组较常氧组的表达高且差异显著（p＜0.01）,说明低氧可短暂促进PASMCs的增殖;通过检测促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2的表达水平发现,低氧可抑制PASMCs的凋亡。此外,检测了细胞暴露于低氧条件下12 h、24 h、48 h和72 h时HIF-1α蛋白的表达情况。结果显示,HIF-1α的表达呈时间依赖性,12～48 h呈上升趋势,48 h表达量最高,48～72 h呈下降趋势,表明低氧可诱导HIF-1α蛋白的瞬时表达。3.将常氧组和低氧组的牦牛PASMCs进行转录组学分析发现,两组中共同表达13330个基因,其中分别只在常氧组和低氧组表达的差异基因数量为277和328个。以p-value＜0.05和|log2FC|≥1为条件筛选组间的差异表达基因（DEGs）,总共筛选出239个DEGs,其中上调基因有192个,下调基因有47个。GO富集分析发现,DEGs显著性富集在与细胞外区域、血管系统发育和低氧反应应答等有关的功能方面;KEGG富集分析发现,DEGs主要参与HIF-1信号通路、TGF-β信号通路和糖酵解/糖异生等通路。选取12个差异表达基因进行q RT-PCR检测,分别从GO富集分析中挑选出7个与血管系统发育和低氧的反应相关的DEGs:ACVRL1、FZD2、AQP1、ID1、EGLN3、BNIP3、DDIT4;从KEGG富集分析中挑选出5个与HIF-1信号通路、TGF-β信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用相关的DEGs:EGLN1、VEGFA、HK2、BMP6、CXCL8。定量验证结果与转录组测序结果的趋势一致,表明测序结果较为可靠。4.将常氧组和低氧组的牦牛PASMCs进行蛋白质组学TMT分析,鉴定到的肽段数量和蛋白质数量分别为19635个和7823个。以p-value＜0.05,上调差异倍数≥1.2,下调差异倍数≤0.8为条件筛选组间的差异表达蛋白（DEPs）,常氧组和低氧组筛选出248个DEPs,其中上调蛋白187个,下调蛋白61个。GO富集分析发现,DEPs显著性富集在与细胞外区域、DNA复制起始、MCM复合体等相关的功能方面;KEGG富集分析发现,DEPs主要参与DNA复制、细胞周期、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用、HIF-1信号通路、MAPK信号通路和NF-κB信号通路等通路。我们从中选取几个差异表达蛋白进行Western blot检测,结果显示,低氧处理后,牦牛PASMCs中HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α蛋白的表达量都较常氧表达量高,且差异显著（p＜0.5）;HIF-1α调控的下游因子HO-1和VEGF,以及TGF-β通路中TGF-β1的蛋白表达量也同样被显著上调（p＜0.5）;MAPK通路中,低氧组p38和JNK蛋白的磷酸化水平也较常氧组的高（p＜0.5）。5.为了验证HIF-1α是否对牦牛PASMCs的增殖和凋亡有影响,我们使用脯氨酰羟化酶（PHD）的竞争性抑制剂DMOG来诱导HIF-1α的表达。DMOG处理可显著提高HIF-1α蛋白水平,且随浓度的增加,HIF-1α和PCNA蛋白水平表达呈上升趋势,而Bax/Bcl-2蛋白含量的比值呈下降趋势。随后在低氧条件下使用LW6药物抑制HIF-1α的表达,同样检测HIF-1α、PCNA、Bax和Bcl-2的蛋白水平,结果与DMOG处理后相反。综上所述,本研究在确定HIF-1α主要定位于牦牛肺动脉平滑肌细胞的基础上,首次成功分离培养了牦牛PASMCs,发现5%O2氧浓度可短暂促进PASMCs的增殖和HIF-1α的表达;转录组和蛋白质组学研究发现低氧可激活血管系统发育、低氧应答反应、DNA复制、细胞周期和TGF-β/HIF-1/MAPK等通路上的关键因子;最后通过药物试验证明HIF-1α可促进牦牛PASMCs的增殖并抑制其凋亡。故本研究为深入研究牦牛肺脏在低氧环境中的适应机制提供理论依据,也为低氧性肺动脉高压的治疗提供了新的思路。