硫化氢（Hydrogen sulfide,H₂S）是继一氧化氮（Nitric oxide,NO）和一氧化碳（Carbon monoxide,CO）之后的第三种气体信号分子。CSE（Cystathionine-γ-lyase,CSE）被认为是心血管系统中主要的H₂S产生酶,主要表达在内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞中。H₂S对心血管系统有多种作用,包括减轻心肌缺血再灌注损伤、促进血管生成、扩张血管和调节血压等。但舒张血管的机制尚不明确。此外,H₂S可以断裂血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor Receptor,VEGFR）cys1045-cys1024之间的二硫键,破坏受体的活性构象,促进内皮细胞的增殖和迁移。VEGFR₂（Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR₂）介导了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的大部分生物学作用,包括促进血管的生成,细胞的增殖,迁移等作用。硫化氢是否通过VEGFR₂发挥脑血管的舒张作用并不清楚。目的:观察H₂S对大鼠脑血管的舒张作用。探讨VEGFR₂对H₂S舒张脑基底动脉的作用及其机制。方法:1. 离体血管直径实验:离体血管直径实验记录大鼠BAs直径的变化:实验分为（1）溶媒对照组;（2）Na HS组;（3）VEGFR₂抑制剂SU5416组;（4）阳性对照VEGF组。观察Na HS(10^-6-10^-3mol/L)对脑血管舒张作用的影响;观察VEGFR₂抑制剂SU5416对脑血管舒张作用的影响;观察VEGFR₂激动剂VEGF对脑血管舒张作用的影响。2. 原代细胞培养:原代培养大鼠BAs平滑肌细胞,检测VSMCs中VEGFR₂的表达。3.转染后的细胞舒张实验:应用细胞转染技术,实验分为Blank、Mock、Negative control、VEGFR₂si RNA1、VEGFR₂si RNA2、VEGFR₂si RNA3,筛选有效的VEGFR₂si RNA序列。应用Image-Pro Plus6.0测定VSMCs舒张幅度的变化。4.在体转染后的离体血管实验:应用VEGFR₂在体转染技术,下调大鼠BAs中VEGFR₂的表达,western-blot鉴定下调后各组织中VEGFR₂表达水平变化。将实验分为溶媒对照组、Na HS组、VEGFR₂si RNA、Negative control,观察转染后Na HS对大鼠脑血管舒张作用的影响。5.钙成像实验:将实验分为Vehicle、Na HS、SU5416+Na HS、VEGF组,检测细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]_i)的变化。实验结果:1.VEGFR₂抑制剂SU5416对H₂S介导BA舒张的影响:与溶媒对照组（Vehicle）相比,H₂S供体Na HS(10^-6-10^-3mol/L)能够浓度依赖性的舒张大鼠BAs,最大舒张率（Emax）达119%±13.7%;VEGFR₂抑制剂SU5416(10^-5mol/L)预处理可显著地减弱Na HS诱导的大鼠BAs舒张,最大舒张率Emax降低为88.0%±12.7%;结果表明H₂S可能通过VEGFR₂发挥脑血管舒张作用。2. VEGF在H₂S介导的BA血管舒张中的作用:与溶媒对照组（Vehicle）相比,VEGFR₂激动剂VEGF(10^-9-10^-5mmol/L)能够引起CBA的舒张最大舒张率为29.6%±10.1%;当用VEGF(10^-5mmol/L)预处理发现Na HS诱导的大鼠CBA舒张减弱。最大舒张率94.7%±6.0%,表明硫化氢舒张大鼠脑基底与VEGFR₂有关,并且可能是通过激活VEGFR₂挥血管的舒张作用。3. 血管平滑肌细胞（VSMC）上VEGFR₂的鉴定:原代培养SD大鼠平滑肌细胞用于鉴定VSMC上的VEGFR₂表达。约4天后,我们可以在显微镜下观察到组织块周围的分散细胞爬升成纺锤形或长纺锤形。两周后,细胞生长更多,并显示“高峰”和“谷”增长。通过抗α-肌动蛋白抗体的免疫细胞化学染色鉴定SMC,在细胞质中观察到长纺锤形的绿色荧光,表明原代培养的SMC是成功的。随后,使用抗VEGFR₂抗体的免疫化学方法鉴定SMCs上VEGFR₂表达,发现VEGFR₂在平滑肌细胞上表达,这为研究VEGFR₂是否参与H₂S介导的脑血管舒张提供了基础。4. 敲低VEGFR₂基因表达对H₂S介导的平滑肌细胞松弛的影响:使用Western bolt法检测VSMC中VEGFR₂蛋白的表达。与对照组相比,使用VEGFR₂-si RNA1可以显著下调VEGFR₂蛋白表达。因此,选择VEGFR₂-si RNA1作为VSMC中的有效干扰序列,以评估VEGFR₂低表达对H₂S介导VSMC松弛的影响。通过给予梯度浓度的外源H₂S供体Na HS(10^-7-10^-3mol/L),观察到VEGFR₂敲低后,VSMC的舒张,结果显示Na HS(10^-5-10^-3mol/L)与对照组相比,较未处理的VSMC舒张,而在VEGFR₂抑制组中,VSMC相对于Na HS组VSMC的舒张受到抑制。5. H₂S对敲低VEGFR₂基因表达大鼠BA舒张的影响:在大鼠转染VEGFR₂-si RNA148小时后,通过蛋白质印迹法检测大鼠基底动脉中VEGFR₂表达。与对照组相比,阴性si RNA组和转染试剂组的VEGFR₂没有明显变化,但si RNA1转染组中VEGFR₂的表达显著降低,约60%。这些结果表明体内转染VEGFR₂-si RNA1可以有效地减少脑血管中VEGFR₂的表达。同时,Na HS对VEGFR₂低表达大鼠的BA松弛作用明显减弱,进一步证实VEGFR₂参与H₂S介导的脑血管扩张作用。6. H₂S通过VEGFR₂对VSMC中钙浓度的影响:接下来,我们研究了H₂S通过VEGFR₂对VSMC中细胞内钙浓度的影响。我们测得Ratio的基本比率为1.9±0.5,当给予U46619(10^-7mol/L)时[Ca²⁺]_i显着增加。相反,当给予Na HS(10^-4mol/L)时[Ca²⁺]_i降低。与SU5416(10^-5mol/L)预育前用Na HS(10^-4mol/L)处理平滑肌细胞后[Ca²⁺]_i降低。结论:1.本研究首次表明H₂S舒张大鼠脑血管作用与VEGFR₂有关,鉴于VEGFR₂激动剂也有舒张作用,提示H₂S可能通过激动VEGFR₂产生大鼠脑血管舒张作用的,当然这有待于今后受体竞争结合实验的进一步证实;2.H₂S可通过VEGFR₂介导[Ca²⁺]_i的降低,产生大鼠脑血管舒张作用;此外,本研究还首次表明VEGF可舒张大鼠脑血管。