【摘 要】
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目的:研究在人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC）中,醛固酮（Aldosterone,Aldo）诱导的自噬蛋白Beclin-1在高醛固酮导致的血管内皮损伤中的作用。方法:1、用醛固酮浓度梯度（0,10,100,1000 nM）作用于HUVEC 12、24、48、72 h,用CCK8试剂盒检测醛固酮作用不同时间后的细胞活力。
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目的:研究在人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC）中,醛固酮（Aldosterone,Aldo）诱导的自噬蛋白Beclin-1在高醛固酮导致的血管内皮损伤中的作用。方法:1、用醛固酮浓度梯度（0,10,100,1000 nM）作用于HUVEC 12、24、48、72 h,用CCK8试剂盒检测醛固酮作用不同时间后的细胞活力。用同一浓度梯度（0,10,100,1000 nM）的醛固酮作用于HUVEC,利用western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1,SQSTM1/p62和LC3的表达量变化,利用试剂盒检测细胞总NO含量的变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。2、用免疫共沉淀法和免疫荧光法证实Beclin-1与盐皮质激素受体（Mineralocorticoid receptor,MR）存在相互作用。在高醛固酮条件下高表达及敲降Beclin-1后再次检测细胞中NO含量的变化和凋亡情况。3、设置对照组、醛固酮组、高醛固酮条件下高表达Beclin-1组,用免疫荧光法和western blot检测细胞核内MR的表达量、免疫荧光法检测MR与溶酶体之间的共定位情况,利用转录组测序获得有显著性差异表达的基因。4、构建Myc-Beclin-1全长和三个截短体质粒,Strep-MR全长和截短体质粒,共转染进入HEK-293T细胞,确定共表达成功后,用Myc免疫磁珠进行免疫共沉淀,检测Beclin-1与MR结合的区域。结果:1、醛固酮对细胞活力的抑制作用具有时间依赖性。醛固酮浓度为100 nM时,作用于HUVEC 48 h开始对细胞活力有显著抑制作用（P＜0.05）。醛固酮作用于HUVEC 48 h,随着浓度升高能够显著上调自噬蛋白Beclin-1,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达,下调p62的表达（P＜0.05）;同时显著减少细胞内NO的合成,增加细胞凋亡率（P＜0.05）。2、Beclin-1与MR存在共定位。在高醛固酮条件下高表达Beclin-1能够逆转醛固酮造成的NO含量下降和凋亡率升高的情况,同时,敲降Beclin-1进一步促进由醛固酮导致的细胞凋亡的发生。3、与对照组相比,醛固酮显著促进MR核易位和MR与溶酶体的共定位。醛固酮的这一作用在高表达Beclin-1后被逆转,相反,在敲降Beclin-1后醛固酮的作用得到进一步增强。4、Beclin-1与MR之间存在相互作用,结合区域为Beclin-1 161-240 AA与MR 601-984 AA。结论:醛固酮诱导产生的Beclin-1能够与MR结合,负反馈调节醛固酮经MR途径诱导的血管内皮细胞凋亡、NO合成的减少以及MR的核易位。
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