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背景与目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,是危害人类生命健康的重大疾病。肺癌包括小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。非小细胞肺癌由肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）和大细胞癌组成。据统计,非小细胞肺癌（NSCLC）是临床上肺癌中最常见的病理类型,其发病率占所有原发性肺癌的85%左右。目前对非小细胞肺癌的发展机制已进行了大量研究,但仍有众多关键科学问题尚未明确,非小细胞肺癌的治疗虽取得一定的进展,但其治疗效果尤其是中晚期病人的治疗仍然十分有限。因此,探讨非小细胞肺癌的发展机制,寻找其诊断和治疗相关的新靶点,具有非常重要的理论意义和应用价值。Rho GTP酶参与调控细胞生长、细胞凋亡、细胞周期进展和细胞骨架形成等多项生命活动。Rho GTP酶的异常激活与乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等多种癌症的发生和发展密切相关。鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）作为Rho GTP酶上游的激活因子,在人类肿瘤中显示出较高的丰度和活性。ARHGEF3是鸟嘌呤核苷酸交换因子家族的成员之一,在Rho GTP酶的活化过程中起关键作用。在急性髓系白血病中,ARHGEF3通过特异性的激活RhoA-ROCK-JNK信号通路来调控癌细胞分化;在鼻咽喉癌中,ARHGEF3通过调控凋亡蛋白BIRC8和caspase-3的表达促进癌细胞的增殖。目前,ARHGEF3在肿瘤方面的研究较少,其在非小细胞肺癌发展中的作用及机制尚未见报导。因此,探索ARHGEF3在非小细胞肺癌发展过程中的作用及分子机制,有助于明确肿瘤的进展机理,为发现新的非小细胞肺癌治疗靶点提供理论依据。材料与方法:1、在临床队列中研究ARHGEF3的表达（1）收集非小细胞肺癌患者临床样本,通过免疫印迹（western blot）和实时荧光定量PCR（Q-PCR）实验分析ARHGEF3在临床非小细胞肺癌组织样本及对应的癌旁正常组织样本中的蛋白和和mRNA表达水平变化。（2）收集非小细胞肺癌细胞株,通过免疫印迹和实时荧光定量PCR实验技术分析正常肺上皮细胞和非小细胞肺癌细胞中ARHGEF3的蛋白和mRNA表达水平变化。2、探索ARHGEF3在非小细胞肺癌细胞恶性增殖过程中的生物学作用（1）利用特异性的siRNA敲低ARHGEF3的表达,通过结晶紫、克隆集落形成以及流式细胞周期分析等实验在细胞水平探讨ARHGEF3在非小细胞肺癌中的生物学功能。（2）通过特异性的shRNA构建干扰ARHGEF3表达的非小细胞肺癌稳定细胞系,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型在体内验证ARHGEF3对非小细胞肺癌细胞增殖的影响。3、探讨ARHGEF3调控非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制（1）在非小细胞肺癌细胞中过表达ARHGEF3,通过质谱技术寻找与ARHGEF3相互作用的靶蛋白。（2）在非小细胞肺癌细胞中,通过免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光（IF）等实验验证ARHGEF3与柠檬酸裂解酶（ACLY）的相互作用关系。（3）在非小细胞肺癌细胞中,过表达或干扰ARHGEF3的表达,通过免疫印迹和实时荧光定量PCR等实验检测ACLY的蛋白水平和mRNA水平的变化,明确ARHGEF3与ACLY之间的表达调控关系。（4）利用分子克隆、免疫印迹、免疫共沉淀等分子实验技术探讨ARHGEF3通过SIRT2调控ACLY乙酰化的具体机制。（5）通过构建ACLY乙酰化功能缺陷的突变体,阐明K17和K86是ARHGEF3调控ACLY表达的关键位点。4、检测ARHGEF3通过调控ACLY的表达对脂肪酸合成的影响在非小细胞肺癌细胞中过表达或干扰ARHGEF3的表达,利用乙酰辅酶A含量测定试剂盒和游离脂肪酸含量测定试剂盒检测乙酰辅酶A和游离脂肪酸的含量变化。5、检测ARHGEF3促进非小细胞肺癌细胞增殖的功能是否依赖鸟苷酸交换因子（GEF）活性（1）通过分子克隆技术构建ARHGEF3的GEF活性缺失的突变体L269E和W440L。（2）利用免疫印迹、免疫共沉淀等实验检测L269E和W440L对ACLY乙酰化的影响。6、在动物水平验证ARHGEF3通过SIRT2调控ACLY的表达进而促进非小细胞肺癌增殖的作用（1）构建ARHGEF3敲低和ACLY过表达的稳定细胞系,通过小鼠皮下成瘤实验检测瘤体的生长速度,验证ARHGEF3是否通过调控ACLY的表达促进非小细胞肺癌增殖。（2）构建ACLY乙酰化功能缺陷的突变体K17R和K86R,通过小鼠皮下成瘤实验比较突变体与野生型ACLY细胞系的致瘤效果,明确K17和K86位点是ARHGEF3调控ACLY表达的关键位点。结果:1、临床队列分析发现ARHGEF3在非小细胞肺癌中高表达（1）ARHGEF3在非小细胞肺癌组织中的表达高于癌旁组织。（2）ARHGEF3在非小细胞肺癌细胞中的表达高于正常肺上皮细胞。2、ARHGEF3促进非小细胞肺癌细胞的增殖（1）利用特异性的siRNA敲低ARHGEF3的表达,发现非小细胞肺癌细胞的生长以及克隆集落形成能力受到显著抑制,细胞周期被阻滞在G0/G1期。（2）利用shRNA构建ARHGEF3低表达的稳定细胞株,体内和体外实验表明非小细胞肺癌细胞的增殖和皮下移植瘤的生长受到显著抑制。3、ARHGEF3调控SIRT2介导的ACLY乙酰化来影响ACLY的蛋白表达（1）ARHGEF3与ACLY存在相互结合。（2）过表达ARHGEF3增强SIRT2与ACLY的相互作用,降低ACLY的乙酰化水平;敲低ARHGEF3的表达,则会使SIRT2与ACLY的相互作用关系减弱,增加ACLY的乙酰化水平。（3）ARHGEF3与乙酰化功能缺陷的突变体K17R和K86R无相互作用,并且对K17R和K86R的乙酰化无影响,表明K17和K86是ARHGEF3调控ACLY乙酰化的重要位点。（4）敲低ACLY的表达,非小细胞肺癌细胞的增殖受到抑制,过表达ARHGEF3仍不能减弱ACLY敲低所致的增殖抑制作用;反之,干扰ARHGEF3的表达会抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,过表达ACLY则会减弱ARHGEF3敲低所致的增殖抑制作用。4、ARHGEF3通过调控ACLY促进脂肪酸合成在非小细胞肺癌细胞中,过表达ARHGEF3会使ACLY的蛋白水平增加,乙酰辅酶A和游离脂肪酸的含量增加;反之,敲低ARHGEF3的表达则会使ACLY的蛋白水平降低,乙酰辅酶A和游离脂肪酸的含量降低。5、ARHGEF3调控ACLY乙酰化不依赖其鸟苷酸交换因子（GEF）活性在非小细胞肺癌细胞中,过表达GEF活性缺失的突变体L269E和W440L,结果显示与野生型的ACLY一样仍使ACLY的乙酰化水平降低。6、ARHGEF3通过调控ACLY的表达促进非小细胞肺癌细胞的增殖和肿瘤形成（1）小鼠皮下成瘤实验结果表明,干扰ARHGEF3的表达,瘤体生长受到显著抑制;过表达ACLY则会减弱ARHGEF3敲低所致的瘤体生长抑制作用。（2）小鼠皮下成瘤实验结果显示,ACLY乙酰化功能缺陷的K17R和K86R突变体稳定细胞株的瘤体重量和体积明显高于野生型的ACLY稳定细胞株。结论:1、ARHGEF3在非小细胞肺癌中异常高表达,并促进非小细胞肺癌细胞的恶性增殖。2、ARHGEF3与ACLY存在相互作用关系。3、ARHGEF3通过SIRT2调控ACLY的乙酰化进而影响ACLY的表达。4、K17和K86位点是ARHGEF3调控ACLY表达的关键作用位点。5、ARHGEF3调控ACLY乙酰化不依赖其GEF活性。6、ARHGEF3通过调控ACLY的表达促进非小细胞肺癌细胞的增殖和肿瘤形成。