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大肠癌（Colorectal Cancer CRC）包括直肠癌和结肠癌，是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率在世界居恶性肿瘤的第三位[1]。据统计，在中国大肠癌的发病率是13.29每10万人[2]，并且发病率逐年增高。大肠癌的死亡率也在逐年上升，大肠癌排在了肿瘤相关死亡原因的男性中第二位、女性中第三位[3]。随着医学技术的不断发展进步，大肠癌患者术后5年生存率达到了50%~70%，相比之前有了较大的提高[4]。有文献报道无淋巴结转移的大肠癌患者，术后五年生存率可达90%[5]，而发生淋巴结转移的大肠癌患者，术后五年生存率一般只有65%[6,7]。可见如果能对大肠癌早发现、早诊断、早治疗，不仅能有效地延长患者的生命，也可以极大地改善患者的生存质量。但由于病情的隐匿，很多大肠癌患者就诊时已到了中晚期，错失了最佳的治疗时机。因此探寻能早期诊断大肠癌的高敏感、高特异的方法是我们一直以来努力的目标。目前在学术界广泛被关注的是分子标志物，因肿瘤标志物检测简便、快速、创伤小、易于接受，在临床中被广泛应用。但由于肿瘤基因的复杂性，目前还很难发现一个敏感度高、特异性高的大肠癌的肿瘤标志物。近些年来兴起的蛋白质组学技术，为我们打开了一扇窗。以蛋白质组学为主体的支撑技术为大肠癌的基础研究和临床应用提供了强有力的手段和支持。我们可以比较分析正常个体和病理个体之间的差异蛋白质，找到具有疾病特异性的蛋白质分子，从而为疾病的早期预测和辅助诊断提供有效的分子标志。这对大肠癌的早期发现、诊断、治疗都将会有很大的帮助。本研究拟应用二维色谱与质谱联用技术检测大肠癌组织与癌旁组织之间的蛋白质表达差异，从而构建大肠癌的差异蛋白质表达谱，以期筛选出可用于辅助诊断大癌肠的分子标记物。在本研究中由于各方面限制不能对筛选出的所有差异蛋白质一一做深入的研究，我们从表达差异的蛋白质谱中筛选出上调蛋白PDIA3作为目标蛋白，采用免疫组织化学方法验证其在大肠癌病人中的表达情况，并对相关的病理参数之间进行了分析。之后我们分析了PDIA3蛋白在不同的大肠癌细胞株的表达情况，构建了PDIA3siRNA的慢病毒表达载体，将其转染表达PDIA3蛋白较高的SW480细胞，在通过RNA干扰技术，检测PDIA3蛋白的表达对大肠癌SW480细胞的凋亡、细胞亚结构、增殖的影响，从而进一步了解了PDIA3蛋白在大肠癌发生发展中的作用。我们的主要研究结果如下：第一部分建立TNMⅢ期大肠癌与癌旁组织的差异蛋白谱方法：1、研究对象：23例TNMⅢ期大肠癌患者，大肠癌组织及配对的癌旁肠粘膜组织标本。2、提取样品组织中的总蛋白，分析蛋白质的浓度。3、制备蛋白水解多肽混合物的样本。4、二维色谱与质谱联用技术，数据库检索分析。5、免疫蛋白印迹实验进行验证。结果：1、大肠癌组织：收集、整理质谱数据，共获得846个蛋白质的鉴定材料。2、配对癌旁肠粘膜组织：收集、整理质谱数据，共获得535个蛋白质的鉴定材料。3、对比分析大肠癌组织与配对癌旁肠粘膜组织的蛋白质谱，共获得24个具有显著性差异的蛋白质，其中在大肠癌组织中有9个蛋白质表达下调，15个蛋白质表达上调。4、免疫蛋白印迹实验证实了蛋白PDIA3在大肠癌组织中的上调表达。第二部分大肠癌病人PDIA3表达与临床病理参数之间的关系方法：1、建立临床病理资料数据库。2、免疫组化法验证PDIA3在大肠癌中的表达，并分析其表达与临床病理参数之间的关系。结果：1、免疫组化证实PDIA3在大肠癌病人中高度表达，主要表达在胞浆。2、在30例大肠癌组织中有28例(93.3%)PDIA3蛋白表达呈阳性，30例配对癌旁肠粘膜组织中有21例(70.0%)PDIA3蛋白表达呈阳性。虽然从阳性率上两者之间没有统计学差异，但从表达强度上来看，与配对癌旁肠粘膜组织相比较，大肠癌组织中PDIA3蛋白的表达强度明显上调，差异具有统计学意义（p<0.01）。3、PDIA3蛋白的表达与大肠癌的分化程度、淋巴结转移有关（p<0.05），而与病人的性别、年龄、TNM分期及远处转移均无关(p>0.05)。第三部分：PDIA3蛋白在大肠癌细胞株中相关生物学功能的研究方法：1、PDIA3蛋白在大肠癌细胞株中的表达。2、PDIA3siRNA表达载体的构建和质粒扩增。3、PDIA3siRNA转染对SW480细胞PDIA3mRNA转录的影响。4、PDIA3siRNA转染对SW480细胞凋亡的影响。5、PDIA3siRNA转染对SW480细胞的亚细胞结构的改变。6、PDIA3siRNA转染对SW480细胞增殖的影响。结果：1、PDIA3蛋白在不同的大肠癌细胞株中均有不同程度的表达，其中在SW480细胞株中表达最强。2、构建的PDIA3siRNA慢病毒重组表达载体能够高效转染SW480细胞(p<0.01)。3、构建的PDIA3siRNA慢病毒重组表达载体能有效沉默PDIA3基因mRNA的表达，差异有统计学意义（p<0.01）。4、转染PDIA3siRNA的SW480细胞的凋亡指数明显高于转染PDIA3control组，差异有统计学意义（p<0.01）。5、PDIA3siRNA转染后，SW480细胞的亚细胞结构发生改变。6、PDIA3siRNA转染后，SW480的细胞活性明显下降，生长受到明显抑制，差异有统计学意义（p<0.05）。通过以上研究，我们得出以下结论：1.建立了TNMⅢ期大肠癌组织与配对癌旁肠粘膜组织的差异蛋白质谱。2.免疫组化法显示PDIA3蛋白在大肠癌病人中高表达，且表达水平与大肠癌的分化程度、淋巴结转移有关（p<0.05），而与病人的性别、年龄、TNM分期及远处转移均无关(p>0.05)。3.筛选出能高表达PDIA3蛋白的SW480细胞株，构建了能高效抑制PDIA3基因表达的GV248慢病毒载体，利用脂质体介导法将重组质粒有效地转染到大肠癌SW480细胞中。4. PDIA3siRNA转染后SW480细胞的生物学行为发生了明显改变： SW480细胞中PDIA3mRNA的表达下降、SW480细胞的凋亡明显、SW480细胞的亚结构被改变、SW480细胞的增殖被抑制，可见PDIA3在大肠癌的发生、发展中发挥着重要的作用，为进一步深入研究奠定了基础。