【摘 要】
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目的:本课题研究支链氨基酸的添加对低蛋白饮食大鼠肝脏的影响,以及恢复正常蛋白饮食后这种作用是否持续存在,并进行初步的机制探索。方法:1.48只SD雄性大鼠随机分为6组:（1）20%正常蛋白饮食4周;（2）4%低蛋白饮食4周;（3）4%低蛋白+4%支链氨基酸饮食4周;（4）20%正常蛋白饮食12周;（5）4%低蛋白饮食4周,恢复正常蛋白饮食8周;（6）4%低蛋白+4%支链氨基酸饮食4周,恢复正常蛋白
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目的:本课题研究支链氨基酸的添加对低蛋白饮食大鼠肝脏的影响,以及恢复正常蛋白饮食后这种作用是否持续存在,并进行初步的机制探索。方法:1.48只SD雄性大鼠随机分为6组:（1）20%正常蛋白饮食4周;（2）4%低蛋白饮食4周;（3）4%低蛋白+4%支链氨基酸饮食4周;（4）20%正常蛋白饮食12周;（5）4%低蛋白饮食4周,恢复正常蛋白饮食8周;（6）4%低蛋白+4%支链氨基酸饮食4周,恢复正常蛋白饮食8周。2.每周记录大鼠体重与进食量,于第4周末行腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT）、腹腔注射胰岛素耐量实验（IPITT）后处死（1）（2）（3）组,于12周末行IPGTT、IPITT后处死（4）（5）（6）组。取大鼠血清进行血糖、血脂等生化指标检测,取大鼠肝脏组织进行H＆E染色、PAS染色、CD68染色,测定肝脏组织甘油三酯含量,采用实时定量聚合酶链式反应检测大鼠肝脏组织中糖代谢、脂代谢、线粒体氧化呼吸链相关基因及炎症因子的mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹检测大鼠肝脏组织中5’磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）表达活性。3.用不含氨基酸的培养基模拟体外低蛋白环境培养hepG2细胞,分别加入支链氨基酸、支链氨基酸+AMPK抑制剂、苏氨酸（Thr,必需氨基酸）、精氨酸（Arg,非必需氨基酸）,试剂盒检测细胞内甘油三酯含量,蛋白免疫印迹检测AMPK及BCKDH表达活性。结果:1.大鼠低蛋白喂养4周后出现体重下降,空腹血糖降低,支链氨基酸的添加使大鼠体重略有增加,但无显著性差异,空腹血糖仍然较低;恢复正常蛋白饮食8周后低蛋白组出现糖耐量异常,而添加支链氨基酸组较低蛋白组表现为糖耐量改善。2.饮食干预4周时低蛋白组大鼠肝脏甘油三酯含量增多,肝细胞脂肪变性增加,肝脏脂质合成相关基因mRNA表达增加,支链氨基酸干预后结果显示:支链氨基酸的添加显著降低肝脏甘油三酯含量（P＜0.05）及肝脏脂质合成相关基因mRNA表达（P＜0.05）,减轻肝脏脂肪变性。恢复正常蛋白饮食8周后低蛋白组大鼠肝脏仍然存在上述脂质沉积相关改变,支链氨基酸的早期添加对肝脏脂质沉积的减轻作用仍然存在。3.在饮食干预4周时,支链氨基酸的添加减轻低蛋白饮食引起的肝脏肝酶增加、巨噬细胞浸润增加、炎症因子表达增加（P＜0.05）;在恢复正常蛋白饮食8周后,支链氨基酸对肝脏慢性炎症的这种改善作用仍然持续存在。4.低蛋白饮食组在饮食干预4周后出现肝脏AMPK活性降低,BCKDH活性降低,支链氨基酸的添加升高AMPK活性及BCKDH活性,且这种改变在恢复正常蛋白饮食后持续存在。5.不含氨基酸的培养基培养hepG2细胞,出现细胞甘油三酯含量增加,AMPK活性降低,BCKDH活性降低,添加支链氨基酸后细胞甘油三酯含量降低,AMPK活性及BCKDH活性升高;在添加支链氨基酸时同时加入AMPK抑制剂,细胞甘油三酯含量增加,AMPK活性降低,BCKDH活性降低;在不含氨基酸的培养基中分别加入苏氨酸、精氨酸,细胞甘油三酯含量并无明显降低,AMPK活性及BCKDH活性也无明显升高。结论:大鼠低蛋白饮食期添加支链氨基酸,能减轻低蛋白饮食所致的肝脏脂质沉积、肝细胞脂肪变性,减少低蛋白引起的肝酶增加、肝脏巨噬细胞浸润增多、炎症因子表达增加;在恢复正常蛋白饮食后,早期低蛋白饮食导致的上述病理改变仍然存在,且早期支链氨基酸的补充对低蛋白饮食导致的病理改变仍有改善作用。除此以外,低蛋白饮食在恢复正常蛋白饮食后出现糖耐量异常,而早期支链氨基酸的添加能改善糖耐量异常。通过体内外实验,发现低蛋白饮食以及低氨基酸干预引起肝脏脂质沉积的原因之一是AMPK活性的降低影响了BCKDH活性,从而使支链氨基酸分解代谢减少,中间产物堆积,进而引起肝脏脂质沉积,而支链氨基酸的添加能通过升高AMPK活性,上调BCKDH活性,从而减轻肝脏脂质沉积,并且其他单个氨基酸的添加无此作用。
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