研究背景:S100A8是一种炎症相关蛋白,参与了炎症的启动、放大以及维持。多种炎症性疾病,如炎性肠病、风湿性关节炎等患者血清中,S100A8均出现了升高,且S100A8升高水平与疾病的严重程度呈正相关。S100A8既是一种胞内蛋白,又是一种分泌型蛋白。分泌型S100A8通过与单核细胞、巨噬细胞等炎症性细胞表面Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）、晚期糖基化终产物受体（Receptor of advanced glycation endproducts,RAGE）、CD68等结合,激活下游信号通路,增强炎症细胞的活化、吞噬,并促进炎症因子的释放。S100A8不仅在炎症疾病中发挥了重要作用,同时也是肿瘤研究领域的明星分子。研究显示,肺癌、乳腺癌等高发病率的癌种中,癌症患者的肿瘤组织中高表达S100A8。且S100A8表达水平升高提示患者临床分期高、预后差,可知S100A8发挥了重要的促瘤作用。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞及免疫细胞中的髓系细胞是表达S100A8的主要细胞组分。一方面,S100A8直接作用于肿瘤细胞。胞外S100A8与肿瘤细胞表面RAGE受体结合,趋化肿瘤细胞迁移;胞内S100A8促进肿瘤细胞高表达基质金属蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase2,MMP2）、基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase9,MMP9）,增强肿瘤细胞侵袭能力;另一方面,S100A8对免疫细胞的影响,主要体现在S100A8发挥类似于趋化因子样的作用,与髓源性免疫抑制细胞（Myeloid Derived Suppressive cell,MDSC）表面受体结合,激活下游NF-κB通路,趋化、招募MDSC至肿瘤组织及肿瘤转移部位,导致MDSC在肿瘤组织及肿瘤转移部位大量聚集,通过增加肿瘤微环境中MDSC数量进而抑制效应T细胞的杀瘤作用或通过促进肿瘤微环境血管生成等,促进肿瘤生长。研究发现,敲除肿瘤细胞中的S100A8,用裸鼠构建皮下种植瘤模型,即免疫缺陷的情况下,肿瘤生长显著减缓。但是用普通C57小鼠构建皮下种植瘤模型,即免疫完全的情况下,肿瘤生长速度无明显改变。以上结果提示我们S100A8作用于肿瘤细胞自身促进肿瘤生长,但在免疫完全的情况下,是否是通过作用于免疫细胞来调节肿瘤免疫,发挥抗瘤效应,从而抑制肿瘤生长?带着这样的科学问题,我们开展了本课题研究,旨在探讨S100A8对免疫细胞的作用及肿瘤生长的影响。为达到探究S100A8对免疫细胞的作用及肿瘤生长影响的研究目的,我们首先选择了不表达S100A8的肿瘤细胞系（LLC、MC38）,其次因造血干祖细胞（Hematopoietic stem progenitor cells,HSPC）是分化为所有免疫细胞的前体细胞,我们在北京百奥赛图公司订购了采用CRISPR/CAS9结合cre-loxp技术构建的造血干祖细胞S100A8组织特异性敲除小鼠,该小鼠可存活、繁殖,且在各种表型上与野生型小鼠无差异,为实验提供了良好的动物模型。本研究首先利用造血干祖细胞S100A8敲除小鼠和野生型小鼠构建荷瘤模型,探究造血干祖细胞S100A8缺失后对肿瘤生长及肿瘤生物学特性的影响;其次探究造血干祖细胞S100A8缺失后对肿瘤免疫的影响;最后进一步探究造血干祖细胞S100A8缺失后对免疫细胞影响的原因机制;通过本研究,拓展了对S100A8在肿瘤免疫及对肿瘤生长作用的认识,为后续研究提供了理论基础。方法:1.探究造血干祖细胞S100A8缺失对肿瘤生长的影响1.1构建造血干祖细胞S100A8 KO小鼠、WT小鼠Lewis Lung cell（LLC）荷瘤模型,记录肿瘤生长曲线、测量肿瘤重量;1.2构建造血干祖细胞S100A8 KO小鼠、WT小鼠MC38荷瘤模型,记录肿瘤生长曲线、测量肿瘤重量;2.探究造血干祖细胞S100A8缺失,对肿瘤生物学特性影响2.1探究肿瘤细胞增殖情况;2.2探究肿瘤细胞凋亡情况;2.3探究肿瘤血管生成情况;3.检测造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下对T细胞比例功能的影响3.1检测并分析肿瘤、脾脏、引流淋巴结中CD8+T细胞、CD4+T细胞比例;3.2检测并分析肿瘤、脾脏、引流淋巴结中CD8+T细胞、CD4+T细胞功能;4.检测造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下对MDSC比例功能的影响4.1检测并分析肿瘤、骨髓、脾脏中MDSC比例;4.2检测并分析肿瘤、脾脏中MDSC功能;5.论证造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下,MDSC诱导T细胞免疫耐受,是促进肿瘤生长的原因5.1检测小鼠淋巴细胞S100A8表达情况;5.2清除S100A8 KO小鼠、WT小鼠体内MDSC,并进行荷瘤,记录肿瘤生长曲线、测量肿瘤重量;6.探究造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下引起MDSC增多的机制6.1分析MDSC分化来源情况;6.2分析MDSC增殖情况;6.3分析MDSC成熟分化情况结果:1.造血干祖细胞S100A8缺失,促进肿瘤生长1.1 LLC荷瘤模型中,KO小鼠较WT小鼠,肿瘤生长更快、体积更大、重量更重;1.2 MC38荷瘤模型中,KO小鼠较WT小鼠,肿瘤生长更快、体积更大、重量更重;2.造血干祖细胞S100A8缺失,肿瘤生物学特性无改变2.1 KO小鼠较WT小鼠,肿瘤细胞增殖无改变;2.2 KO小鼠较WT小鼠,肿瘤细胞凋亡无改变;2.3 KO小鼠较WT小鼠,肿瘤血管生成无改变;3造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下肿瘤微环境中T细胞免疫耐受3.1 KO小鼠较WT小鼠,仅肿瘤组织中CD8+T细胞比例降低,脾脏及引流淋巴结中CD8+T细胞比例无改变;3.2 KO小鼠较WT小鼠,仅肿瘤组织中CD8+T细胞功能受损,脾脏及引流淋巴结中CD8+T细胞功能无改变;3.3 KO小鼠较WT小鼠,肿瘤、脾脏、引流淋巴结中CD4+T细胞比例均无改变;3.4 KO小鼠较WT小鼠,仅肿瘤组织中CD4+T细胞功能受损,脾脏及引流淋巴结中CD4+T细胞功能无改变;4.造血干祖细胞S100A8缺失,MDSC增多,功能无改变4.1 KO小鼠较WT小鼠,在肿瘤、骨髓、脾脏中均存在MDSC比例、数量增多;4.2 KO小鼠较WT小鼠,MDSC功能无改变。5.造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下,MDSC增多诱导T细胞免疫耐受,是促进肿瘤生长的主要原因5.1小鼠淋巴细胞不表达S100A8;5.2清除MDSC后,KO小鼠、WT小鼠肿瘤生长体积、重量无差异;6.造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下,细胞分化发生髓系偏移导致MDSC增多的机制6.1造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下,造血干祖细胞向MDSC分化增多;6.2造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下,MDSC增殖无改变;6.3造血干祖细胞S100A8缺失,荷瘤状态下,MDSC向下游成熟分化能力无改变;结论:1.HSPC中S100A8缺失,肿瘤生长加速;2.HSPC中S100A8缺失,MDSC增多,导致T细胞免疫耐受是促进肿瘤生长的原因;3.HSPC中S100A8缺失,HSPC分化过程发生髓向偏移是MDSC增多的机制。