论文部分内容阅读
一、单中心3659例MDS患者的回顾性临床及遗传学特征研究(1995-2018)目的:收集我中心1995年至2018年满足2016 WHO分型标准的3659例初诊MDS患者回顾性分析其一般临床、细胞遗传学及分子遗传学特征,揭露各方面特征对MDS诊断及预后的影响,建立符合中国人变异谱的新的预后风险评估模型,并进一步分析国内外MDS患者的差异及单中心移植情况。方法:1.采用维也纳最低诊断标准(2007年)诊断MDS患者,完善我中心初诊MDS患者的基本信息,系统性分析患者的临床及实验室特征,再用2016版WHO分型标准予以分型。2.通过最新的高通量DNA检测技术检测747例初诊MDS患者中与血液系统疾病高度相关的51个基因的变异,总结我中心MDS患者的变异谱及其对预后的影响,借助R语言软件建立结合患者临床信息及细胞遗传学、分子遗传学特征的新的预后风险模型体系。3.应用各种统计分析方法及COSMIC数据库,系统性分析我中心与西方国家MDS患者的差异特征,探讨各差异特征之间的关联。4.回顾性分析我院299例移植患者的总体治疗情况,并比较MDS成人患者移植前地西他滨治疗情况,分析其对移植后生存的影响。结果:1.我中心3659例初诊MDS患者中男性为主(58.0%,2124/3659),中位就诊年龄55岁(1-93岁),中位白细胞计数为2.77×109/L(0.11~106.10×109/L),中位血红蛋白量为75g/L(10-180g/L),中位血小板计数为55×109/L(1~1504×109/L),中位原始细胞比率为3.0%。按照WHO(2016)分型标准,MDS-MLD亚型最为多见(1216例,33.23%),MDS-EB-1 653 例(17.86%),MDS-EB-2 750 例(20.50%),MDS-U 329 例(8.99%),其他各亚型 MDS-SLD 463 例(12.65%)、MDS-RS-SLD 154 例(4.21%)、MDS-RS-MLD 52 例(1.42%)、5q-综合征 42 例(1.15%)。2.我中心MDS患者核型多为正常(53.76%,1967/3659),异常核型是全部核型的38.49%(1408/3659),而复杂核型有410(11.21%,410/3659)例。染色体畸变最常见三体或单体异常,具体多见+8(32.89%,464/1408)核型异常,然后依次可见-7/del(7q)(17.20%,242/1408)、del(5q)(17.10%,241/1408)和 del(20q)(16.80%,236/1408)异常。3.NGS检测的747例初诊MDS患者中68.01%(508/747)至少具有一种及以上的基因变异,每例患者的中位基因变异个数为1个(0-7个)。最常见的基因变异类型为转录因子相关基因(33.87%,253/747)及RNA剪切变异(28.51%,213/747)。5%以上的常见的基因变异为:ASXL1(15.70%,117/747)、U2AF1(15.39%,115/747)、RUNX1(10.70%,81/747)、DNMT3A(9.10%,68/747)、TP53(8.70%,65/747)、TET2(7.75%,58/747)、SF3B1(7.63%,57/747)、KRAS/NRAS(6.69%,50/747)、SETBP1(5.09%,38/747)。结合患者的年龄、IPSS-R分层以及DNMT3A、GATA2和TP53基因变异这些独立影响预后因素的加权系数,我们得到新的模型公式:Age*0.8+IPSS-R*0.5+GATA2*1.2+DNMT3A*0.9+TP53*0.8,并依此分为三类:低危组(<2.25),中危组(2.25-4.05),高危组(4.05-5.7)。新模型的C-index(0.777)优于单纯的IPSS-R危险分层(0.713),IPSS危险分层(0.67)和年龄矫正的IPSS-R危险分层(0.754)。该模型在165例鉴定组及99例移植患者验证评估且有效运行。4.我中心MDS患者具备区别于西方国家的独特特征,主要表现为发病群体更加年轻,低于西方国家的5q-核型异常检出,反之更高的+8和20q-核型异常,同时具备更多的U2AF1基因变异。经关联性分析及Logistic回归分析显示患者年龄与+8染色体异常,U2AF1基因变异具备显著关联意义,且为患者带来更多的C>T碱基变异。5.我中心2010-2018年行异基因造血干细胞移植治疗MDS患者共299例,其中单倍体移植156(52.2%)例,同胞全相合89(29.8%)例,无关全相合54(18.1%)例。患者移植后中位随访时间22月(1-95月),三种不同移植方式的累计总体生存率和无进展生存率一致。通过比较移植前不同的治疗方式发现在MDS-EB患者中地西他滨单药治疗患者移植后总体生存优于支持治疗有或无伴DAC桥接预处理及DAC联合预激方案组。结论:1.我中心MDS患者的临床及遗传学特征具有其特异性,主要表现为更年轻化的患者带来更多的+8核型异常和U2AF1基因变异。2.通过结合特异分子异常、年龄和IPSS-R预后积分系统建立适用于中国人的新预后模型,为患者的预后判断和治疗选择提供良好的指导。3.移植前DAC单药治疗为MDS-EB组患者较其他处理带来更好的预后。二、红系增生增多的骨髓增生异常综合征的特征和致病机制研究目的:探讨伴红系增生增加(MDS with erythroid predominance(≥50%erythroid nucleated cells),MDS-E)MDS患者的发生率、临床特征及可能的致病机制,并建立评估MDS-E患者预后的个性化的风险评分系统。方法:从我中心2010-2018年初诊骨髓形态信息完整的2603例MDS患者中筛选出627例MDS-E患者,并同时与1976例非红系显著增生的MDS(MDS with less than 50%erythroid nucleated cells,简称MDS-NE)患者和伴红系增生增加的76例AML(The acute myeloid leukemia(AML),not otherwise specified(NOS)(≥50%erythroblasts),AEL)对比,从NGS水平、总体RNA基因表达量及单细胞RNA测序三个方向上阐述了MDS-E区别于其他MDS或AEL的独特特征及可能导致红系异常增生的因素。结果:1.基于2016年WHO分型我中心诊断的2603例MDS中有627(24.1%)例MDS-E 患者,中位年龄 56 岁(9-89 岁),较 MDS-NE 年轻(56VS58 岁,P=0.045)。MDS-E 患者男女比率(1.30:1)与 MDS-NE 及 AEL一致。MDS-E 依然以 MDS-MLD(40.0%,251/627)最为多见,其次为 MDS-EB1(20.3%,127/627),MDS-EB2(14.7%,92/627)。随着WHO分型从2008版更迭为2016版,有111例患者从AEL分别迁移到MDS-E中的MDS-EB1(34例)和MDS-EB2(77例)中,同时可见MDS-E患者较MDS-NE患者分布更多的MDS-MLD和MDS-EB1病例。另外,相较之AEL及MDS-NE患者,MDS-E 患者有更高的单体核型比率(8.2%(162/1976)VS 9.2%(7/76)VS 12.9%(81/627),P 均<0.05)。2.本次研究通过对179例的MDS-E患者、516例MDS-NE及31例AEL行高通量NGS测序发现MDS-E患者常见(>10%)的基因变异为U2AF1(17.88%,32/179),TP53(12.85%,23/179),SF3B1(11.17%,20/179),RUNX1(10.06%,18/179)和 ASXL1(10.06%,18/179)。有趣的是,MDS-E患者较MDS-NE的患者有着显著的更高的TP53(12.57%VS7.35%,p=0.043)和 SF3B1(11.43%VS6.19%,p=0.030)基因变异比率。我中心结合了 IPSS危险分层,年龄和3个基因变异,建立了 MDS-E患者个性化Cox模型的新预后评分系统:IPSS*0.9+TP53*1.1+NRAS/KRAS*1.1+SF3B1*1.2。新模型对结局判断的C-index(0.711)优于单纯的IPSS-R危险分层(0.604)和IPSS危险分层(0.630)。3.采用10x Genomics公司提供3’单细胞RNA转录组学测序(V2版)捕获和检测分别来自3例MDS-E及3例MDS-NE骨髓共42749个细胞,发现相较于MDS-NE患者,随着MDS-E造血干细胞/多能造血前体细胞及红系原始细胞分化持续上调的差异基因只有以下 7 个:ATP6V1E1,HENMT1,PIGBOS1,PRR34-AS1,SNW1,VAMP2,ZFR。分别在 HEL 细胞系中敲除 ATP6V1E1,HENMT1,PIGBOS1,SNW1,VAMP2,ZFR基因后发现最终在敲除ATP6V1E1基因时其红系相关标志CD71和CD235a显著减低。结论:1.MDS-E的特征介于MDS-NE和AEL患者之间,TP53及SF3B1基因变异是其特异性标志。2.ATP6V1E1基因在MDS-E造血干细胞/多能造血前体细胞及红系原始细胞分化持续上调,调控细胞的红系表达。3.独特的基因组和转录组特征将MDS-E定义为一种新型亚型,同时建立这一亚型预后的个性化的风险评分系统,均可能会促进其精确的诊断,预后分层和治疗管理。三、EVI1高表达推进MDS向AML转化目的:系统性分析我中心不同EVI1表达量的MDS患者的一般临床、细胞遗传学及分子遗传学特征,分析不同EVI1表达在MDS中的作用,通过体内外实验、RNA测序及全外显子测序分析其分子生物学异常,并初步探讨其可能的致病机制。方法:1.自2010年1月至2018年12月于本中心就诊的2372例MDS中筛选伴骨髓EVI1表达量测定的成人患者,共1033例纳入研究,以300copies/10000ablcopies为cut-off将其分为EVI1高表达及低表达2组,回顾性分析其临床和预后特征。2.依据靶向测序技术对不同EVI1表达量的492例MDS患者进行基因变异检测,揭示其分子异常特征,并构建针对不同EVI1表达量的MDS患者更精准的预后模型。4.透过NHD13小鼠与EVI1过表达的敲基因小鼠杂交,获取NHD13+EVI1high小鼠,比较EVI1过表达在MDS小鼠转白及生存过程中的影响。5.通过不同MDS阶段小鼠的RNA测序,比较其分子生物学异常,并初步探讨其可能的致病机制,同时在转白的小鼠中予以验证。6.根据上述结果选取针对EVI1高表达的MDS的靶向候选药物,在体内外实验中验证药物的疗效和特异性。结果:1.我中心首先收集了 1033例检测初诊骨髓EVI1表达的MDS患者,分为EVI1高表达及低表达2组,其中高表达229例,占全部患者的22.2%,且高表达较低表达组年轻和有更多的MDS-EB亚型(P<0.001)。值得注意的是,EVI1高表达的MDS患者较低表达组有更多的病例进展比率(12.7%VS 5.6%,P=0.015),尤其是向急性白血病转化(8.7%VS 5.4%,P=0.045)。进一步分析可见EVI1高表达组患者的总体生存及无事件生存显著差于EVI1低表达组。2.高通量NGS检测492例不同EVI1表达量的MDS患者51个血液肿瘤相关基因变异,可见EVI1高表达患者中74.6%(97/130)至少具有一种及以上的基因变异,依次常见的基因变异为:U2AF1(23.1%,30/130)、ASXL1(16.2%,21/130)和 TP53(12.3%,16/130)等,相较于 EVI1 低表达患者有更多的 U2AF1、KRAS/NRAS、EZH2、JAK2、和ETNK变异,及较少的RUNX1变异。另外针对不同EVI1表达量,我中心同时结合年龄、IPSS-R预后分层、分子遗传学变异(TP53、DNMT3A及SF3B1基因)构建新的分子分型和预后分层模型:Age*0.8+IPSS*0.6+EVI1*0.2+TP53*1+NRAS*0.7+SF3B1*0.9。模型分值范围为0-5.2,以1.2和3.0为cutoff,并依此分为三类:低危组(<1.2),中危组(1.2-3.0),高危组(3.0-5.2)。新模型对预后评估的一致性(C-index=0.741)优于单纯的IPSS-R危险分层(0.649)和IPSS危险分层(0.653),提示EVI1表达量及分子异常对MDS预后分层具有重要意义。最后在154例验证组患者总体生存中发现该模型完全适用,同时也适用于无事件生存的预后评估,然而鉴于进展病例少,进展生存在验证组评估效果差。3.选取NHD13小鼠为MDS背景小鼠,与EVI1过表达的敲基因小鼠杂交,获取NHD13+EVI1high、NHD13+EVI1normal、NHD13-EVI1high 及 WideType(WT)共 4 种小鼠,发现伴有EVI1高表达的NHD13小鼠随着年龄的增加逐渐出现外周血象的不同程度的减低,且具备较正常MDS小鼠更恶劣的血象下降情况,主要表现为更低的血红蛋白、HCT、红细胞计数及血小板计数。重要的是NHD13+EVI1high较NHD13+EVI1normal更快进展为急性白血病(中位转白时间259天VS未及364天,P=0.0044)。4.通过不同EVI1表达MDS小鼠骨髓前体细胞(c-kit阳性)RNA测序推测其中Cdkn2a、Foxc1 及 Rorc 可能在 NHD13+EVI1high 较 NHD13+EVI1normal 小鼠更快的转白过程中发挥一定的作用。在转白小鼠中再次检测各基因表达发现Cdkn2a、Rorc为NHD13+EVI1high特异性表达,且随着疾病的进展显著升高(20倍-100倍),Foxcl同样为NHD13+EVI1high 特有且随NHD13+EVI1high 进展而下调,在NHD13+EVI1normal转白中无变化,这些基因可以调控表观遗传或其异常表达多由表观遗传调控引起。5.EVI1在小鼠体内确实推动了 MDS转白的进程,进一步设计表观遗传学药物JQ1及DAC在MDS模型小鼠中的作用。体外实验提示NHD13+EVI1high对JQ1药物治疗高度敏感,较NHD13+EVI1normal、NHD13-EVI1high及WT均显著减少骨髓c-kit+细胞克隆形成能力。在转化的白血病的骨髓c-kit阳性细胞中发现JQ1及DAC依然可以显著抑制c-kit+白血病细胞克隆形成和增殖,且两种药物具有协同作用,然而转白后两组在同一种药物作用下的抑制作用并无差异。NHD13+EVI1high小鼠体内JQ1单药治疗(50mg/kg)提示其一定程度阻滞EVI1高表达的MDS小鼠转白进程。并进一步构建小鼠EVI1高表达的PDX模型,研究其在MDS转白过程的推进作用,探讨JQ1的治疗作用。结论:1.EVI1高表达在MDS病人及小鼠体内均带来不良预后及更快的白血病转化进程。2.表观遗传学调控在转白进程中扮演重要作用,BRD4抑制剂JQ1体外显著抑制前体细胞的集落形成能力,体内亦阻滞EVI1高表达的MDS转白进程。