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食管癌(esophageal cancer,EC)是引发癌症相关死亡的主要原因之一,我国新发食管癌病例中以食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)居多。随着医疗技术的进步,尽管目前在食管癌的治疗方面已经获得了长足的进展,但由于其五年内总体生存率仍保持在较低水平,因此食管癌的早期诊断依然是一个问题。肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者血清中具有出现较早且稳定性较好的特点,现已被用于多种癌症的早期发现和诊断,同时探究癌症驱动基因在肿瘤发生过程中的生物学作用也能够更好的了解肿瘤发生的机制,为临床诊断食管癌提供更多的理论基础。目的基于本团队前期研究成果,进一步检测抗GNA11自身抗体在ESCC患者中的表达水平,评价其在ESCC中的诊断价值;通过慢病毒构建稳定过/低表达gna11的食管鳞癌细胞株探讨GNA11在食管鳞癌发生过程中的生物学功能。方法1.ELISA和Western blotting实验检测抗GNA11自身抗体在ESCC患者血清中的表达水平并评价其在ESCC中的诊断价值(1)ELISA检测抗GNA11自身抗体在ESCC患者血清中的表达水平及诊断价值评价将频数匹配的243例ESCC患者和243例正常对照(normal control,NC)按照3:7的比例随机分为小样本组(73 ESCC VS 73 NC)和大样本组(170 ESCC VS170 NC)。使用间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗GNA11自身抗体在两组样本中的表达水平,通过非参数检验比较抗GNA11自身抗体在ESCC组和对照组中的表达是否有差异,通过受试者工作特征(ROC)曲线评价抗GNA11自身抗体对ESCC患者以及不同临床亚组ESCC患者的诊断价值。(2)Western blotting检测ESCC患者血清中抗GNA11自身抗体的表达随机选取ESCC患者和正常对照血清各8例,将转有GNA11蛋白的硝酸纤维素膜切成单独的条带并与相应的血清进行反应。通过生物化学发光仪检测条带上的阳性反应信号。2.GEPIA数据库和免疫组化实验验证GNA11在食管癌中m RNA、蛋白的表达水平(1)GEPIA数据库分析GNA11在食管癌组织中m RNA的表达水平基于基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库比较GNA11在食管癌患者和正常对照中m RNA的表达是否有差异。(2)免疫组织化学及Western blotting方法检测GNA11蛋白在食管鳞癌组织中的表达通过免疫组织化学(IHC)技术检测GNA11蛋白在75例ESCC组织和75例癌旁组织的表达;通过Western blotting检测GNA11蛋白在正常食管细胞株HEEC和四种食管鳞癌细胞株Eca109、KYSE105、TE1及KYSE150细胞中的表达。3.构建稳定过/低表达gna11的食管鳞癌细胞株探索GNA11表达对食管鳞癌细胞功能的影响通过慢病毒构建稳定过/低表达gna11的食管鳞癌细胞株。通过CCK8及克隆形成实验检测GNA11表达对ESCC细胞增殖能力的作用,通过细胞划痕及Transwell迁移实验检测GNA11表达对ESCC细胞迁移能力的作用,通过Transwell侵袭实验检测GNA11表达对ESCC细胞侵袭能力的作用。结果1.抗GNA11自身抗体在ESCC患者中的表达水平升高(1)ELISA结果表明,在小样本中抗GNA11自身抗体在ESCC患者中的表达水平中位数为0.305,而在健康对照组中的表达水平中位数为0.276,两组表达水平的差异具有统计学意义(P<0.05),其诊断ESCC患者的AUC为0.653(95%CI:0.563-0.742),灵敏度为10.96%,特异度为98.63%;在大样本集中抗GNA11自身抗体在ESCC组的表达水平中位数为0.340,而在健康对照组的表达水平中位数为0.280,两组表达水平的差异具有统计学意义(P<0.05),其诊断ESCC患者的AUC高达0.751(95%CI:0.699-0.803),灵敏度为38.24%,特异度为88.82%。抗GNA11自身抗体在临床各亚组中的阳性率没有差异;其在各临床亚组中诊断ESCC的AUC范围是0.661-0.774,且在各临床亚组中的诊断价值之间差异无统计学意义(P>0.05),但在性别亚组中表现出了边界性差异(P=0.05)。(2)Western blotting结果表明,在选取的8例ESCC血清中有6例均在GNA11蛋白相应的分子量附近出现了阳性条带,而在选取的8例对照血清中均未出现阳性反应条带。2.GNA11在食管鳞癌中的mRNA、蛋白表达水平升高(1)生物信息学分析表明,GNA11在食管癌中的m RNA表达水平明显高于正常对照者(P<0.05)。(2)IHC结果表明,GNA11蛋白在ESCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。(3)Western blotting结果表明,GNA11蛋白在Eca109、KYSE105及KYSE150细胞中的表达水平明显高于正常食管上皮细胞HEEC(P<0.05)。3.Western blotting和q PCR结果表明成功构建了稳定过/低表达gna11的食管鳞癌细胞株。4.GNA11表达升高时TE1细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力明显提高;当GNA11表达降低时,KYSE150及TE1细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力明显降低。结论1.抗GNA11自身抗体在食管鳞癌患者血清中表达升高以及其对不同临床特征食管鳞癌患者的诊断价值,使得其可能成为潜在的食管鳞癌血清诊断标志物。2.GNA11表达变化能够影响食管鳞癌细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力。