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目的:本研究采用D-半乳糖（D-galactose,D-gal）构建小鼠衰老模型,从整体上探讨不同时间给予二至丸（Erzhi pill,EZP）对D-gal所致衰老小鼠的保护作用,并通过网络药理学（Network pharmacology）进一步研究二至丸抗衰老的时辰药理机制,潜在的活性组分以及作用靶点,以期为二至丸在临床抗衰老的研究以及合理应用提供一定的实验基础和理论依据。方法:1.整体动物实验:（1）将60只C57雄性小鼠随机分为对照组,D-gal组和1:00,7:00,13:00,19:00不同时间给药组,D-gal组和给药组小鼠每日（16:00时）皮下注射300mg·kg-1D-gal造模,连续给药56d,对照组小鼠皮下注射等体积的生理盐水。于第11d开始,给药组分别于1:00,7:00,13:00,19:00给予2.5g·kg-1二至丸灌胃,连续给药46天,对照组和D-gal组小鼠给予生理盐水灌胃,上述各组给药体积均为0.1ml·10g-1。（2）每日给药后监测各组小鼠的饮食,体重,毛发,和精神状态等体征的变化;于末次给药次日进行行为学实验,检测小鼠的行为特点（Y迷宫,新物体识别,Morris水迷宫实验）及学习记忆能力。（3）于行为学结束次日下午16:00时,摘眼球取血,脱臼处死,摘取小鼠大脑和肝脏组织,检测各组小鼠血清中CAT、SOD、MDA的水平;HE染色观察大脑和肝脏组织病理学形态改变,Nissl染色观察小鼠大脑神经元尼氏小体变化;免疫组化检测大脑中BMAL1和CRY1的表达和分布;Western blot检测大脑生物钟因子CLOCK,BMAL1,PER2,CRY1的表达。2.网络药理学实验:（1）通过TCMSP数据库、Genecard数据库和OMIM数据库检索得到二至丸,衰老及生物钟对应靶点,并汇总筛选,获得共同靶点。对交集靶点进行网络分析,构建PPI网络,进行KEGG富集分析和GO富集分析,获取关键靶点和作用通路,构建化合物-靶点-通路网络图。（2）分析总结二至丸的核心有效成分,作用靶点,并通过分子对接,对核心有效成分与靶蛋白氨基酸残基结合位点,自由结合能进行构象分析评价。结果:1.动物实验:（1）D-gal组小鼠经连续56d皮下注射D-gal后,出现毛发颜色晦暗,并严重脱落,精神状态变差,嗜睡等衰老表现,表明衰老模型构建成功,经给予二至丸后,小鼠的外观体态较D-gal组改善。（2）行为学实验表明,D-gal组小鼠的学习记忆能力与对照组相比,显著下降。给予二至丸干预后,小鼠的学习记忆能力有明显改善,且不同时间给予二至丸改善效果不同。Y迷宫实验中,与对照组相比,D-gal组小鼠的自发交替率和新臂识别指数降低（P＜0.01）,与D-gal组小鼠相比,1:00和7:00组小鼠的自发交替率（P＜0.01,P＜0.01）和新异臂识别指数明显升高（P＜0.01,P＜0.05）;新物体识别实验中,与对照组相比,D-gal组小鼠的新物体识别指数降低（P＜0.01）,与D-gal组相比,1:00、7:00和19:00组小鼠的新物体识别指数显著升高（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）;Morris水迷宫,定位航行试验中,随着训练天数增加,观察到各组小鼠到达平台的逃逸潜伏期时间缩短,在第5d的训练中,与对照组相比,D-gal组小鼠的潜伏期显著延长（P＜0.01）,而与D-gal组相比,1:00和7:00组的逃逸潜伏期明显缩短（P＜0.01,P＜0.01）。在空间探索试验中,与对照组相比,D-gal组小鼠沿目标方向轨迹最少,沿壁移动的频率最高,逃逸潜伏期明显延长（P＜0.01）,在目标象限相对运动距离缩短（P＜0.01）,与D-gal组相比,1:00,7:00组沿目标方向运动轨迹明显,潜伏期明显缩短（P＜0.05,P＜0.05）,在目标象限相对运动距离延长（P＜0.01,P＜0.01）,行为学实验结果表明,二至丸可以改善小鼠的学习记忆能力,且具有显著的时间差异性,其中于1:00和7:00给予二至丸的改善作用最为明显。（3）血清指标检测结果表明,与对照组相比,D-gal组小鼠血清中的CAT,SOD含量显著降低（P＜0.01）,MDA含量显著升高（P＜0.01）,与D-gal组相比,1:00和7:00给药组小鼠血清中的CAT,SOD含量明显升高（P＜0.01,P＜0.01）,MDA含量明显下降（P＜0.01,P＜0.01）。上述血清指标结果显示,二至丸的抗衰老作用可能与其抗氧化应激的作用有关,且其抗氧化应激的能力与二至丸的给药时间相关,其中于1:00和7:00给予二至丸的抗氧化作用最好。（4）病理染色结果:在大脑组织HE染色结果中,D-gal组小鼠大脑皮质区及海马CA3区神经元核固缩深染,排列紊乱,表现出明显的神经元损伤现象,经二至丸治疗后,1:00组和7:00组小鼠神经元损伤减少,13:00组和19:00组与D-gal组相比则无明显改善。在大脑Nissl染色中,D-gal组和13:00,19:00神经元固缩现象明显,神经元细胞核空泡样变,尼氏体减少,CA2区细胞数量减少,细胞排列疏松。在肝脏组织HE染色结果中,正常组小鼠肝细胞正常,细胞排列整齐,而D-gal组小鼠肝组织出现大片水肿样变和核固缩深染现象,1:00和7:00给药组小鼠肝细胞水肿和核固缩深染现象减轻,部分伴有少量炎细胞浸润现象。13:00和19:00给药组小鼠肝组织表现出与D-gal组相似的病理损伤现象。结果表明二至丸对衰老导致的组织病理损伤具有保护作用,且具有明显的时间差异性。（5）大脑免疫组化结果显示,与对照组相比,D-gal组小鼠BMAL1和CRY1的表达水平显著下降（P＜0.01）,与D-gal组相比,1:00和7:00组小鼠BMAL1表达水平显著升高（P＜0.01,P＜0.01）,而各给药组CRY1表达水平均由明显升高（P＜0.01）;大脑western blot结果显示,与对照组相比,D-gal组小鼠CLOCK,BMAL1,PER2,CRY1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01或P＜0.05）,与D-gal组小鼠相比,1:00给药组小鼠CRY1,BMAL1,PER2,CLOCK蛋白表达水平显著升高（P＜0.01或P＜0.05）,7:00给药组小鼠CRY1,PER2,CLOCK蛋白表达水平显著升高。说明D-gal诱导的衰老小鼠生物钟相关因子的表达降低,二至丸处理后,能够提升小鼠生物钟基因CRY1,BMAL1,PER2,CLOCK的表达,且具有时间差异性,其中于1:00和7:00给药提升效果最好。2.网络药理学实验（1）通过检索得到二至丸有效活性成分22个,对应靶点203个,衰老靶点26473个,生物钟靶点2536个,三者交集靶点128个;通过PPI网络拓扑分析得到8个核心靶点:MAPK1、JUN、RELA、TP53、MYC、ESR1、FOS和TNF;GO基因富集分析结果显示,二至丸药理作用靶点主要涉及细胞周期,信号转导等;KEGG富集结果显示,IL-7信号通路,PI3K/AKT信号通路等是二至丸作用的关键核心通路;通过二至丸活性成分-核心靶点-通路网络分析,二至丸3’-O-Methylorobol、Quercetin、Luteolin、Kaempferol和Acacetin等活性成分,通过MAPK1、RELA、TP53、MYC和TNF等多种靶点参与IL-17、TNF、PI3K-Akt等多条信号通路的调节。（2）分子对接结果中,3’-O-Methylorobol、Quercetin、Luteolin、Kaempferol和Acacetin等活性成分,与MAPK1、RELA、TP53、MYC和TNF等核心靶点具有良好的结合活性。结论:二至丸对D-gal诱导的小鼠衰老模型具有显著保护作用,且这种作用具有明显的时间特异性,于1:00和7:00给予二至丸的抗衰老效果明显优于13:00和19:00,其机制可能与抗氧化应激,恢复核心生物钟相关基因表达,改善衰老所致的生物钟节律紊乱有关。网络药理学及分子对接结果表明,二至丸的多种活性成分,通过作用于多个靶点,参与衰老生物钟共相关的多条通路的调节来发挥作用,为生物钟作为中药作用的潜在靶点提供实验基础和理论依据,也为二至丸在临床抗衰老的研究以及合理应用提供一定的参考。