【摘 要】
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禽白血病（avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALV）引起发病鸡生产性能下降、产生免疫抑制、发生良性或恶性肿瘤的家禽传染性疾病,是危害养禽业健康发展的重要疾病之一。由于ALV可通过垂直传播和水平传播方式扩散且无商业化的疫苗或药物防治,现阶段国内外防控AL主要是通过净化种鸡群。自2012年起,从我国部分地方品种鸡中陆续分离出与已知ALV不同
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2016YFD0501606）； 国家自然科学基金（31672552）； 广东省自然科学基金（2016A030313403）； 广东省家禽产业技术体系疾病控制岗位专家（2018LM1114）； 国家肉鸡产业技术体系岗位科学家（CARS-41-
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禽白血病（avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALV）引起发病鸡生产性能下降、产生免疫抑制、发生良性或恶性肿瘤的家禽传染性疾病,是危害养禽业健康发展的重要疾病之一。由于ALV可通过垂直传播和水平传播方式扩散且无商业化的疫苗或药物防治,现阶段国内外防控AL主要是通过净化种鸡群。自2012年起,从我国部分地方品种鸡中陆续分离出与已知ALV不同亚群的外源性ALV,随后被我国学者命名为ALV-K。近年来,越来越多的ALV-K被发现,且不同地区不同品种鸡ALV-K分离株的复制能力和致病性存在差异。为了解广东省不同黄羽肉种鸡场ALV-K的感染情况,本研究对A、B、C三个规模化种鸡场送检的4批次共1217份抗凝血浆接种DF-1细胞,培养9 d后用ELISA检测细胞培养液上清中ALV p27抗原。结果显示这4批次黄羽肉种鸡血浆样品外源性ALV病毒分离阳性率分别为4.18%（13/311）、9.67%（29/300）、26.3%（47/179）、1.4%（6/427）。分别对DF-1病毒分离阳性样本提取前病毒DNA进行常规PCR亚群鉴定和env克隆测序,结果从中鉴定出5株ALV-K,分别命名为GD17KL58、GD17NH10、GD17HD93、GD17HD88和GD17B2。为进一步了解黄羽肉种鸡ALV-K流行株基因的遗传衍化特点,通过以ALV前病毒DNA为模板进行分段PCR扩增和克隆测序的方法,获取上述5个ALV-K分离株的全基因组序列。序列分析结果表明5个分离株长度分别为:7479 bp、7479 bp、7479bp、7482 bp、7482 bp,均符合典型反转录病毒科甲型病毒属基因组结构,不含已知的致瘤基因。基于gp85核苷酸序列遗传进化树分析表明,这5个分离株与我国报道的ALV-K亚群毒株JS11C1、GDFX0601及日本毒株Km-5943的gp85核苷酸相似性均达95.3%以上,与ALV-K参考株均处于同一个独立分支。基于LTR核苷酸序列遗传进化树分析表明,这5个ALV-K分离株与内源性ALV-E参考株ev-1相似性达98.9%,与ALV-K参考株GDFX0601和ev-1等处于同一个大分支,属于内源性LTR的ALV-K。为比较黄羽肉鸡与蛋鸡ALV-K流行株之间的基因差异,将源自江苏绿壳蛋鸡的ALV病毒分离阳性细胞上清感染DF-1细胞,提取前病毒DNA,经特异性PCR扩增和IFA试验发现ALV-K分离株GDJS147混有ALV-J。为获得其全基因组序列,通过抗ALV-K感染细胞系DF-1\K和抗ALV-J感染细胞系DF-1\J分离纯化GDJS147,提取其前病毒DNA通过分段PCR克隆测序的方法获得ALV-K分离株GDJS147全基因组长度为7581 bp。基于全基因组序列相似性分析显示:GDJS147的gag基因与ALVJ相似性最高,pol基因与ALVE-B9相似性为98%;LTR与ALV-J参考株相似性为89.2%～92.9%,且5’LTR区包含2个CAAT boxes,2个CAr G boxes、2个Y boxes和1个PRE box、TATA box,仅比ALV-J原型株HPRS-103转录调控元件少1个PRE box。基于gp85核苷酸序列遗传进化树分析表明,GDJS147的gp85基因与从黄羽肉种鸡分离的5个ALV-K分离株相似性为95.7%～97.4%,与ALV-K分离株位于同一个大分支但独立处于一个小分支,说明与黄羽肉种鸡源ALV-K分离株亲缘性相对较远。以上结果表明,ALV-K分离株GDJS147是一株具有外源性LTR的ALV-K/ALV-J重组病毒。为了解ALV-K/J重组病毒的基因结构,以ALV-K/J重组病毒GDJS147前病毒DNA为模板将全长分三段顺次克隆至p MD19-T simple载体获得重组质粒p MD19-GDJS147。将重组质粒p MD19-GDJS147经脂质体转染DF-1细胞,盲传3代后,通过ELISA检测培养液p27抗原,其结果显示该细胞培养物S/P值均值为2.057;RT-PCR结果显示能扩增出约1214 bp的ALV-K gp85条带;IFA和Western blot检测结果显示拯救病毒均能表达p27蛋白,表明克隆毒r GDJS147拯救成功。体外复制实验表明克隆毒r GDJS147的复制能力高于本课题组早期分离的ALV-K毒株GDFX0601（P＜0.05）。综上所述,广东多个黄羽肉种鸡场核心群仍有ALV-K的流行,这些种禽场仍需切实做好AL净化工作。基于全基因组序列的遗传演化分析表明ALV-K与ALV-J等其他亚群ALV共感染时,易形成ALV-K/J重组病毒。ALV-K/J重组病毒GDJS147感染性克隆的构建为进一步研究ALV-K分子致病机制提供了基础。
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