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人源胸腺素α原(prothymosinα,proTα)是具有促进细胞增殖和显著的免疫刺激活性的酸性蛋白,主要用于治疗肿瘤、肝炎、免疫系统等疾病。白介素2(interleukin 2,IL-2)是一种糖蛋白,它能增强NK细胞的活性,对肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、直肠癌有明显疗效,但过量使用IL-2会带来不良反应。ProTα和IL-2存在紧密的免疫刺激协同作用,proTα通过调节IL-2诱导的NK敏感细胞和LAK细胞毒性,使IL-2的有效浓度降低一半。它们协同于自体瘤的效果明显强于单独使用IL-2的效果。ProTα和IL-2联合使用不但能提高抗肿瘤的效果,还可降低单独使用IL-2产生的毒副作用。本研究利用PCR技术从前期构建好的pcDNA3.1-PTI重组质粒中克隆出proTα-linker-IL-2融合基因,并对其进行改造,在5′端加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的信号肽序列。将改造好的proTα-linker-IL-2融合基因(PI)克隆至真核载体pVAX中构建成重组质粒pVAX-PI,再将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,通过菌落PCR和酶切筛选阳性单菌落,提取质粒进行测序鉴定。测序结果显示,改造后的融合基因序列与预期序列一致。提取无内毒素的重组质粒pVAX-PI并定量分析。采用脂质体转染试剂将重组质粒转染哺乳动物细胞COS-7中进行表达,分别收集质粒转染细胞后24h、48h、72h、96h的细胞上清,用ELISA法定量分析细胞上清中IL-2蛋白表达量,结果显示,24h、48h、72h、96h转染上清中的IL-2蛋白含量分别为5.4、7.8、6.1、5.7ug/L。采用CTLL-2依赖细胞株测得转染后24h、48h、72h、96h细胞上清中的IL-2活性分别为43、58、54、49IU/ml。将小鼠原代脾细胞与细胞转染上清一起培养48h后,MTT实验结果表明,转染上清能刺激小鼠脾细胞增殖,表达的融合蛋白具有proTα的活性。最后,通过ECL western blotting分析和鉴定了表达的融合蛋白的分子量约为31kDa。本次研究初步发现pVAX-PI对小鼠黑色素瘤有一定的抑制作用,并且对荷瘤鼠体内细胞因子IFN-γ和IL-4均有一定的诱生作用。pVAX-PI质粒免疫组的小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量随时间的推移而逐渐上升。荷瘤小鼠接种pVAX-PI质粒后第5周,ELISA定量分析小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量,肌肉注射联合在体电脉冲刺激组分别为222pg/ml和157pg/ml,单纯肌肉注射组分别为129pg/ml和68pg/ml。以上结果说明,pVAX-PI质粒在荷瘤鼠的免疫体系中具有一定调节作用。