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自1953年提出DNA的双螺旋结构以来,DNA杂交解链一直是人们研究的热点。其中DNA杂交动力学及其机制是一个越来越受到关注的问题。DNA末端是众多功能的起点,而成为DNA研究的焦点之一。但是末端运动相比较DNA整体行为而言有快速,以及难于检测的特点。传统动力学方法很难进行研究,而近年发展起来的光学荧光技术可以提供高灵敏高速度的检测条件。
荧光涨落谱方法通过控制被检测的分子的数量、检测系统的高灵敏度和对环境噪音的控制而检测到分子运动产生的涨落信号。分子的涨落信号中包含了分子扩散、化学反应和荧光基团自身的变化等各种运动的信息,通过数学的处理提炼出我们关心的化学反应动力学信息。荧光涨落谱的动力学研究摒除了阶跃方法的近似性和阶跃条件,在动态平衡中观察分子的动态行为。
本论文利用荧光涨落谱(FFS:fluorescence fluctuation spectroscopy)和荧光共振能量传递(FRET:fluorescence resonance energy transfer)现象,研究了DNA双链末端在水溶液中的运动,在分子水平上得到了对DNA末端碱基对杂交解链动力学过程的描述。
本论文的工作分为两个部分:
·实验工作
·针对实验的理论工作论文的主要成果包括:
(1)搭建了荧光共聚焦FFS显微镜装置,这套装置将三个可见光波段的激光引入显微镜,可以同时使用或切换不同的激发光;可以灵活地应用于体系的荧光光强、双色荧光、荧光偏振等荧光共聚焦实验。
(2)设计并实现了实时控制并检测溶液温度的实验装置。
(3)将上述两套装置结合起来进行了不同温度下的涨落谱实验。本套装置具有空间稳定性(2小时空间飘移<1μm)、温度稳定性(检测过程中温度波动<0.2℃)和时间稳定性(整个实验过程中约4小时,聚焦体积没有明显变化)。
(4)设计了满足检测条件的荧光标记的DNA样品,设计保证了样品在升温实验中的温度跨度内的稳定性和观测的可靠性。获得大量DNA杂交解链的荧光涨落光谱.
(5)本论文的一个特色是针对实验数据所作的理论工作。我们针对自己实验数据与文献数据的差异和参考文献中关于DNA双链杂交解链的理论,提出了自己的物理模型,用这个模型成功地研究处理了自己的实验数据,并找到了文献中实验结果彼此有差异的根源。
新的模型以DNA双链的拉链模型(Zip-model)为出发点,考虑到可能参与末端运动的每一个碱基的贡献;得到以碱基为单位进行描述的势能面。理论与实验研究结合在一起得到以下结论:
·以碱基为单位进行的反应活化焓主要由碱基对的反应焓决定
·杂交和解链的基元反应的活化熵都是正值,说明过渡态是一个相对松散的状态
·杂交的活化熵大于解链的活化熵
·确定DNA末端运动的多通道结论不仅来自于参与运动的碱基数目,更来自于单个碱基杂交解链的多通道势垒结构。我们拓展了相关函数的应用范围:使之不再局限于化学反应的两态假设模型,可以处理多步的复杂体系,不再局限于两种发光状态的假设。