【摘 要】
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目的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起COVID-19大流行,目前疫情防控形势仍然十分严峻。本研究基于簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system,CRISPR-Cas）、多酶恒温快速扩增技术（Multienzyme isoth
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目的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起COVID-19大流行,目前疫情防控形势仍然十分严峻。本研究基于簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system,CRISPR-Cas）、多酶恒温快速扩增技术（Multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA）和人源（Human internel reference,HR）免疫层析试纸,探讨建立针对新型冠状病毒及其4种突变（H69/V70 del、T478K、N501Y和P681H）的CRISPR免疫层析法检测技术,以满足疫情防控对病毒感染快速精准检测的需要。方法1.用MEGA7软件分析新型冠状病毒和6种人冠状病毒的全基因组序列,查找新型冠状病毒核衣壳（Nucleocapsid,N）蛋白基因的特异性保守序列。2.构建携带新型冠状病毒野生株基因组中的N基因、棘突（Spike,S）蛋白基因和4个变异位点核酸序列的重组质粒,并对重组质粒进行T7体外转录,获得各变异位点的核酸标准品。3.在新型冠状病毒N基因的特异性保守序列内设计Cas13a蛋白的检测靶点,在S基因的四个变异位点处设计Cas12a蛋白的检测靶点。化学合成相应的CRISPR-RNA（crRNA）。4.建立CRISPR/Cas荧光检测体系和MIRA扩增体系,筛选各检测靶点的crRNA及其特异性扩增引物。5.设计HR免疫层析试纸,并建立CRISPR免疫层析法检测体系。用新型冠状病毒核酸标准品评价N基因Cas13a核酸检测系统的检测下限和特异性;用体外转录的核酸标准品评价各变异位点Cas12a核酸检测系统的检测下限。6.用经RT-PCR验证的临床标本评价建立的新型冠状病毒N基因和T478K变异位点的CRISPR免疫层析法检测的灵敏度和特异度。结果1.构建了靶向新型冠状病毒N基因的Cas13a荧光法和免疫层析法检测体系,确定了检测体系中牛磺酸、氯化镁、T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂的最适终浓度分别为10 mM、20 mM、1.5 U/μL和0.8 U/μL。2.设计了HR免疫层析试纸,并用Cas13a免疫层析法检测新型冠状病毒核酸标准品和阳性临床标本。检测结果显示,阳性临床标本在检测试纸的质控线2显色,标准品在试纸的质控线2不显色。3.靶向新型冠状病毒N基因的Cas13a免疫层析法检测的检测下限为0.25copies/μL。该检测方法可将新型冠状病毒和甲流（H3N2）、乙流（Victoria）以及其他6种人冠状病毒特异性区分。在经RT-PCR方法确诊的52份阳性和101份阴性临床标本的检测中,Cas13a免疫层析法的灵敏度和特异度均为100%。4.靶向新型冠状病毒T478K变异位点的Cas12a免疫层析法的检测下限为10 copies/μL,在对经RT-PCR确诊的28份Delta阳性和24份Delta阴性的新型冠状病毒患者临床标本的检测中,灵敏度为92.8%,特异度为100%。5.靶向新型冠状病毒H69/V70 del、N501Y和P681H变异位点的Cas12a免疫层析法的检测下限分别为10 copies/μL、10 copies/μL和100 copies/μL。结论1.基于CRISPR、MIRA和HR免疫层析试纸建立的CRISPR免疫层析法检测可以区分人源临床标本和其他来源标本的新型冠状病毒核酸,从而对人源标本的采样、核酸提取和扩增环节进行质量控制。2.基于Cas13a蛋白构建的针对新型冠状病毒N基因的Cas13a免疫层析法检测,可以实现对新型冠状病毒高灵敏高特异的现场检测。3.基于Cas12a蛋白构建的针对新型冠状病毒H69/V70 del、T478K、N501Y和P681H突变的Cas12a免疫层析法检测,可以实现对新型冠状病毒4种突变的现场识别。
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