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目的:课题组前期工作发现转凝蛋白（Transgelin-2）是针刺抗哮喘效应蛋白MT-2的结合蛋白,并通过激光共聚焦荧光显微镜发现二者在气道平滑肌细胞膜表面存在结合。然而,目前没有其它证据表明Transgelin-2是膜蛋白,其跨膜方式、跨膜区域尚不清楚。因此本论文通过生物信息学方法对Transgelin-2蛋白跨膜区域、信号肽等进行预测分析。并构建Transgelin-2两个亚型的融合表达载体,通过蛋白诱导表达及纯化技术获得两个亚型蛋白,为Transgelin-2蛋白特性及功能研究提供理论和物质基础。此外,Transgelin-2与MT-2的具体结合位置,以及Transgelin-2在舒张气道平滑肌中的作用仍不明确,因此我们利用SPR技术研究Transgelin-2与MT-2全长及两个亚基的相互作用,进一步通过RNAi干扰技术构建Transgelin-2低表达大鼠气道平滑肌细胞,并检测MT-2对正常和Transgelin-2低表达平滑肌细胞收缩舒张功能的影响。以期明确Transgelin-2的理论跨膜特性,明确Transgelin-2与MT-2全长及亚基的结合关系,阐明Transgelin-2在舒张气道平滑肌中的生物学效应,为Transgelin-2跨膜信号传导机制、细胞识别和生物学意义的研究提供理论依据,为针刺抗哮喘效应物质基础研究提供新的科学依据。方法:1.利用Clustal W生物分析软件,将已在蛋白或转录水平被验证的人、大鼠、小鼠、牛、黑猩猩5个物种的Transgelin-2蛋白氨基酸序列进行比对,分析5个物种间Transgelin-2的同源性和进化关系,为蛋白功能研究提供亲缘依据;利用MEMSAT等3种在线分析工具预测人Transgelin-2跨膜区域,并用Phobius和Signal P预测工具排除信号肽干扰,为Transgelin-2结构和功能研究提供依据和方向。2.根据人Transgelin-2不同亚型和蛋白特性,分别构建p Cold II-Transgelin-2和p GEX-6P-1-Transgelin-2融合表达载体,利用大肠杆菌表达体系诱导表达后,依次利用亲和层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析方法纯化得到高纯度、高浓度的Transgelin-2亚型1（Isoform 1）和亚型2（Isoform 2）蛋白,为功能验证提供工具蛋白。3.采用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）技术,检测Transgelin-2与针刺抗哮喘效应蛋白MT-2全长、α和β亚基的结合和解离动态过程,分析Transgelin-2与MT-2全长及其亚基的相互作用关系。4.利用RNAi干扰技术构建Transgelin-2低表达大鼠ASMCs,并利用实时无标记细胞分析系统（Real-Time Cell Analysis,RTCA）,检测针刺抗哮喘效应蛋白MT-2对经乙酰胆碱（ACh）诱导的正常和Transgelin-2低表达大鼠ASMCs的拮抗收缩作用。结果:1.人、小鼠、大鼠和牛的Transgelin-2序列同源性均高于90%,其中人与牛的序列同源性最高为98.99%,人与黑猩猩的序列同源性为13.07%。2.三种跨膜预测软件预测结果提示人Transgelin-2两个亚型均存在多个跨膜段,且跨膜区域大部分位于钙调蛋白同源结构域（Calponin Homolog Domain,CH Domain）内,并可排除信号肽干扰。3.成功构建了人重组Transgelin-2蛋白融合表达载体,分别为p Cold II-Transgelin-2 Isoform 1、p Cold II-Transgelin-2 Isoform 2和p GEX-6P-1-Transgelin-2 Isoform1。4.成功诱导表达了人Transgelin-2 Isoform 1蛋白,且解决了蛋白纯化过程中出现的蛋白降解和多聚问题,并通过逐层纯化获得浓度为3.3 mg/m L的高纯度的目的蛋白。5.成功诱导表达了人Transgelin-2 Isoform 2蛋白,通过逐层纯化获得浓度为3.1mg/m L高纯度的目的蛋白。6.Transgelin-2与针刺抗哮喘效应蛋白MT-2全长存在结合,平衡解离常数KD值为446 n M,但与MT-2的α和β亚基在10 n M和100 n M这2个浓度下均不存在结合。7.MT-2浓度为360 ng/m L时,对经ACh诱导的正常大鼠ASMCs具有明显的拮抗收缩效应（P＜0.05）,而对经ACh诱导的Transgelin-2低表达大鼠ASMCs没有拮抗收缩作用（P＞0.05）。结论:1针刺抗哮喘靶标Transgelin-2两种亚型均可能是跨膜蛋白。2针刺抗哮喘靶标Transgelin-2在不同物种的进化关系上存在种属特异性,人、小鼠、大鼠和牛的Transgelin-2具有高同源性和高保守性,而人与黑猩猩的同源性和保守性较低。3针刺抗哮喘靶标Transgelin-2蛋白与针刺抗哮喘效应蛋白MT-2全长存在特异性结合关系,与MT-2的α和β亚基在10 n M和100 n M这2个浓度下无结合关系。4针刺抗哮喘效应蛋白MT-2特异性通过针刺抗哮喘靶标Transgelin-2发挥舒张大鼠ASMCs的作用。