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金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）是一种属于兰科石斛属的附生型多年生草本植物,为我国历版药典所收载,具有滋阴清热、益胃生津的功效,其用热蒸馏法所得的药露“石斛露”更有养胃阴、平胃逆、除虚热、安神志的功效。金钗石斛主要活性化合物和指标性成分是石斛碱,是一种含有15个碳的Picrotoxane型倍半萜类生物碱,《中国药典》规定其含量在金钗石斛中不得低于0.4%。截止目前,石斛属中已有94种Picrotoxane型化合物被报道,从这些化合物中推测出石斛碱的前体为含Picrotoxane骨架的化合物。石斛碱的获得主要从金钗石斛植物中用溶剂提取,使用溶剂提取不仅得率低同时资源损耗大。尽管石斛碱的化学合成已有成功案例,但限于其合成条件苛刻、成本高和得率低等而无法推广应用。而合成生物学集合了生物学和工程学的优点,通过对工程菌的定向改造,能提高药用天然产物的产量并有效节约植物资源。因此,开展对石斛碱的生物合成研究就显得尤为必要且紧迫,目前对石斛碱的合成生物学研究正处起步阶段,而中间体化合物的分离纯化对于解析生物合成途径也十分重要。另一方面,市场上的石斛通常在炮制过程中将其烘干制成干品石斛“枫斗”,石斛特殊剂型石斛露鲜有文献报道,但因其有特殊的滋胃阴、清热、养胃的功效,未来应用市场广泛。基于此,本文主要围绕金钗石斛开展了两方面的初步研究:①从金钗石斛干燥茎的60%乙醇浸膏中分离中间体化合物,并对石斛碱生物合成途径中细胞色素氧化酶（Cytochrome P450,CYP450）基因的表达进行了初步分析,以期为石斛碱生物合成途径中关键酶基因的表达提供基础资料;②以金钗石斛新鲜植株为材料,初步开展了热蒸馏提取工艺对其营养成分的影响变化,以期为该提取工艺在金钗石斛中的应用研究奠定基础。主要结果如下:1、从菌根真菌诱导金钗石斛构建的转录组的文库中筛选出2条与石斛碱合成途径相关的差异显著的酶基因,对其进行了根、茎、叶组织特异性分析、与石斛碱组织含量的相关性分析和序列生物信息学分析;随后,利用Primer Premier 5.0设计出2对引物,克隆得到了DnCYP86B1、DnAP两条基因,长度都在1500 bp左右,将DnCYP86B1、DnAP插入载体pET-28a构建重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE检测后发现重组蛋白。结果表明:在组织表达差异中,DnAP在组织特异性分析中表现为茎＞根＞叶,与石斛碱的含量差异相符,推测其有可能参与石斛碱的生物合成途径;在生物信息学分析中,DnCYP86B1蛋白序列与铁皮石斛转录组中的烷烃羟化酶DcAH同源性较高,推测其与石斛碱合成途径中间体的羟基化有关,DnAP与铁皮石斛转录组的天冬氨酸蛋白酶DcAP同源性较高,推测其可能具有类似催化天冬氨酸蛋白C-N键水解功能,与石斛碱合成途径中[NH2]的重排有关;在原核表达中,DnAP在0.1mM IPTG条件诱导下表达出了不可溶性蛋白,约为55 kD,DnCYP86B1未发现表达。2、以金钗石斛干燥茎为材料,通过60%乙醇加热回流提取、正丁醇和二氯甲烷依次萃取、酸提碱沉,各种柱层析分离及半制备高效液相进行制备纯化,最后通过核磁共振谱图反映的信息特征鉴定化合物的结构。共得到3个化合物,分别为生物碱类化合物石斛碱（Dendrobine）,木脂素类 Lyoniresinol,脂肪酸类正三十二烷酸（Dotriacontanoic acid）。实验通过酸提碱沉方法富集了二氯甲烷部分的石斛碱,为石斛碱之后的活性研究提供丰富原料。正三十二烷酸经Scifinder、Dictionary of Natural Products（DNP）数据库检索发现未在石斛属植物中发现,并经知网、Pubmed、百度学术、谷歌学术查找标题和摘要关键词“Dotriacontanoic acid”亦未发现在石斛属植物中被报道,正三十二烷酸可能为首次从金钗石斛中分离得到。3、以新鲜金钗石斛全株为材料,利用无溶剂热蒸馏法处理,并回收蒸馏所得物（露）,蒸馏后的干品金钗石斛为露渣,检测其露与露渣中的营养成分（多糖、石斛碱、氨基酸与总黄酮）,以金钗石斛鲜样为对照CK,观察露中所含的营养成分的变化。在营养成分差异上,露渣的营养成分含量除多糖外均有不同程度降低。露渣中的营养成分含量相比CK,多糖减少了 16.26%,石斛碱含量成分减少了 14.71%,16种氨基酸含量减少了 20%～33%,总黄酮的含量减少了 16.67%,露中按本研究方法未能检出多糖、石斛碱、氨基酸与总黄酮。以上实验结果,①首次从金钗石斛中分离得到正十二烷酸,并富集了金钗石斛中的石斛碱成分,为下一步石斛碱活性实验的深入研究提供原料;②对石斛碱生物合成途径中2条相关基因的表达和功能进行了初步探索,为石斛碱合成途径中的关键酶基因的原核表达和功能研究奠定了基础,为最终揭示和解析石斛碱生物合成提供基础资料;③发现了金钗石斛鲜材在热蒸馏过程前后的营养成分变化,其鲜样品中的营养成分含量更高;首次对其热蒸馏提取物（露）进行回收并检测其含量,发现露中不含各种营养成分。