猪链球菌病是由多种致病性链球菌感染引起一种传染性疾病,是我国农业部规定的二类动物传染病,它不仅可引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎和局部脓肿等症状,还可导致生猪从业人员的感染和死亡,是一种重要的人畜共患传染病,造成严重的经济损失和公共卫生安全性问题。头孢噻呋是治疗猪链球菌病的主要药物,但由于市售制剂的半衰期短使其在本病的治疗中需要多次重复用药及其不合理使用情况屡有发生,使其用药顺应较差和不能达到最佳疗效,在造成治疗失败的同时易导致细菌耐药性的产生,药物残留量增加,甚至产生毒副作用,危害动物健康。因此本课题拟利用可注射缓控释制剂技术研制长效盐酸头孢噻呋混悬注射液,并开展该混悬剂对猪链球菌的药动-药效学同步模型研究,制定出其治疗猪链球菌病的最佳给药方案,使其达到最佳的疗效的同时,增加用药的顺应性,减少生产成本和对动物的刺激,避免和减少细菌耐药性的产生,延长头孢噻呋在临床上的使用寿命。1.盐酸头孢噻呋混悬注射液的研制本课题采用胶体磨法制备盐酸头孢噻呋混悬注射液,利用正交实验设计法,以静置24h后的沉降体积比、重分散性作为考察指标,对助悬剂、抗氧化剂和表面活性剂的处方组成和用量进行筛选,并对优化制备的混悬液的外观性状、沉降体积比、重分散性、通针性、粒度、p H、含量和体外缓释性能等质量指标进行评价。利用光加速实验和长期稳定性试验对其稳定性进行了考察,通过小鼠急性毒性试验、猪肌肉刺激性试验和溶血性试验对盐酸头孢噻呋混悬注射液的安全性进行考察。试验结果表明盐酸头孢噻呋混悬注射液的优化配方是以100 m L的油酸乙酯为溶媒,2%单硬脂酸铝为助悬剂,0.5%司盘-80为表面活性剂、0.3%丁基羟基茴香醚为抗氧化剂。本混悬液的沉降体积比为1,在30转/分钟条件下6s内即可均匀重新分散,6-12号针头均易抽取,粒径在1.42～1.64μm之间,p H在5左右,平均回收率100.18%～100.30%。体外释放表明制备的盐酸头孢噻呋混悬注射液和参比制剂速解灵分别在12h和8h释放完全,表明本混悬剂具有明显的缓释效果。安全性评价显示本注射剂的毒性较低,半数致死量LD50为4073.80mg/kg;注射部位无明显眼观病变和局部不良反应;无溶血发生。光加速试验和长期稳定性试验结果表明该注射液在4500Lx强光下照射10天后和在30±2℃、相对湿度60±5%的条件下处理6个月后,外观、粒度分布等质量指标无明显变化,沉降体积比略有下降,符合药典相关规定。2.盐酸头孢噻呋混悬注射液的药动学研究本试验中将12头6周龄左右,体重18～22kg的健康三元杂交猪,雌雄各半,按照2×2交叉试验设计随机分为A、B两组,每组6头。常规伺养观察7d后,分别按照5mg/kg.b.w的剂量对各组进行肌肉注射,第一组颈部深层肌内注射对照制剂（速解灵）,第二组肌内注射受试制剂（盐酸头孢噻呋混悬注射液）,间隔7d后,第一组肌内注射受试制剂,第二组肌内注射对照,制剂,分别在给药后0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96和120h于前腔静脉采集血液5m L,置入有抗凝剂肝素钠的离心管,室温下静置2h,4000r/min离心15min,取上清液,经二硫赤藓糖醇（DTE）提取以及HLB固相萃取小柱净化后用高效液相色谱法（HPLC）检测血浆中去呋喃甲酰基头孢噻呋的含量,血药浓度数据经Winnonlin药动学软件拟合药-时曲线,计算并比较各药动学参数。结果表明建立的高效液相色谱方法灵敏度高、专属性好,线性方程为y=44353x-16489,相关系数r=0.9988,最低检测限（LOD）为0.05μg/m L,最低定量限（LOQ）为0.10μg/m L,低中高三个添加浓度的回收率在77.64～82.37%,批内和批间变异系数小于7%,可用于盐酸头孢噻呋混悬注射液在猪体内的药动学研究。药动学研究表明本课题研制盐酸头孢噻呋混悬注射液注射8h后,血药浓度达到最高峰,且在注射120h仍能检测到药物;而速解灵注射后2h后达到药峰浓度,且在72h几乎检测不到药物。与速解灵相比,自制盐酸头孢噻呋混悬注射液的生物利用度提高了2.16倍,达峰时间延长了6h,消除半衰期延长了6.53h,平均驻留时间（MRT）延长了9.3h。上述结果说明制剂头孢噻呋混悬注射液吸收好且平稳,生物利用度高,有明显的长效缓释作用。3.药动-药效学（PK-PD）同步模型研究采用皮下接种10~9CFU/m L猪链球菌cvcc607的方法建立猪链球菌病感染模型,同时设立健康猪对照组,以5mg/kg剂量（以CEF计）肌肉注射盐酸头孢噻呋混悬注射剂后于0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120h采集血浆,于0、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120h运用支气管纤维镜采集肺泡灌洗液,采用高效液相色谱法测定血浆和肺泡灌洗液中药物浓度,另一部分进行间接体内细菌培养,绘制间接体内杀菌曲线。采用微量肉汤稀释法分别测定头孢噻呋在肉汤培养基和肺泡灌洗液中对猪链球菌的MIC和MBC,并在此基础上配制系列浓度的头孢噻呋对猪链球菌绘制杀菌曲线。同时采用平板计数法测定头孢噻呋对猪链球菌的最小防突变浓度（MPC）和抗菌后效应（PAE）。将体内的药动学参数与半体内的药效学数据结合,计算体内PK-PD结合参数值,通过Winnonlin软件模拟半体内PK-PD值与抗菌疗效之间的关系,确定PK-PD模型方程,利用剂量计算方程计算头孢噻呋达到预防、治疗和根除效应的给药剂量,制定合理的给药方案。结果表明:头孢噻呋在肉汤培养基和肺泡灌洗液中对猪链球菌cvcc607的MIC均为0.25μg/m L、MBC均为0.5μg/m L,说明头孢噻呋在肉汤培养基和肺泡灌洗液有相同的抗菌活性;头孢噻呋对猪链球菌的最小防突变浓度（MPC）为1μg/m L;猪链球菌与1MIC、2MIC、4MIC浓度的头孢噻呋接触1h的抗菌后效应（PAE）分别为0.13、0.45、0.87h,猪链球菌与1MIC、2MIC、4MIC浓度的头孢噻呋接触2h的抗菌后效应（PAE）分别为1.54、1.80、2.15h,说明头孢噻呋对猪链球菌杀菌特点表现出明显的浓度依赖性。采用Winnonlin软件对药物浓度数据进行拟合,结果表明头孢噻呋在健康猪和患病猪体内均符合非房室模型,头孢噻呋在健康猪肺泡液中的主要药动学参数:药时曲线下面积（AUC）、峰浓度(Cmax)、达峰时间（Tmax）、末端消除半衰期(T1/2)、末端消除速率（Ke）、表观分布容积（Vd）、清除率（CL）和平均驻留时间（MRT）分别为112.65μg*h*m L-1、3.69μg*m L-1、8.00h、69.44h、0.010h-1、3.58±0.511 L/kg、0.036L/h/kg和34.21h;头孢噻呋在患病猪肺泡液中的主要药动学参数:药时曲线下面积（AUC）、峰浓度(Cmax)、达峰时间（Tmax）、末端消除半衰期(T1/2)、末端消除速率（Ke）、表观分布容积（Vd）、清除率（CL）和平均驻留时间（MRT）分别为100.43μg*h*m L-1、3.42μg*m L-1、8.00h、66.92±9.66h、0.011h-1、3.88L/kg、0.040L/h/kg和34.12h;结合头孢噻呋对猪链球菌的杀菌特征和PAE结果确定指导头孢噻呋对猪链球菌杀菌特点的PK-PD参数为AUC/MIC,采用Winnonlin软件对半体内（ex vivo）药效学数据进行拟合,发现头孢噻呋对猪链球菌的PK-PD模型为S型Emax模型,即Hill模型。利用Sigmoid Emax模型对半体内杀菌曲线试验中AUC24h/MIC值与链球菌浓度变化对数值之间的关系进行拟合,计算当E=0、-3和-4时所需要达到的PK/PD参数AUC24h/MIC分别为7.23、9.18、11.35h,结合剂量方程制定头孢噻呋的给药方案:预防、治疗和根除效应的日给药剂量分别为1.28、1.62、2.02mg/kg,给药间隔为79.3h,在治疗剂量2.02mg/kg,每3天肌肉注射一次的给药方案下,可有效避免耐药性的产生。综上所述,本课题成功研制出一种能显著提高药物生物利用度并具有长效缓释作用的盐酸头孢噻呋混悬注射剂,并通过其对猪链球菌cvcc607的药动‐药效学（PK-PD）同步模型研究,制定出一套科学的给药方案,为头孢噻呋治疗猪链球菌病提供了事实可靠的临床应用学依据,使头孢噻呋达到最佳疗效的同时减少了细菌耐药性的产生,增加了临床用药的方便性。