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目的抗肾小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)肾炎是一种严重的急性肾小球疾病,病变类型多样,典型表现为新月体肾小球肾炎,包括新月体形成、血管袢坏死、系膜扩张等,具有发病快,预后差等临床特点。在新月体肾炎中,CD4+辅助T细胞可分化为产生不同细胞因子的效应T细胞亚群从而引起炎症细胞浸润、炎症介质释放并引发免疫损伤。Th17细胞的活化与增殖被认为是新月体肾炎早期病变的关键细胞,抑制Th17细胞介导的免疫反应将直接影响新月体肾炎的病理进程。细胞信号分子的可逆泛素化修饰被认为是细胞响应细胞外刺激的关键机制,泛素特异性蛋白酶25(Ubiquitin-specific protease 25,USP25)被报道在调节机体免疫方面起重要作用。因此,本研究将通过小鼠抗GBM肾炎模型探讨USP25对抗GBM肾炎免疫进程的影响,从而为早期干预抗GBM肾炎免疫激活,减轻肾脏免疫损伤提供理论依据。方法首先,通过小鼠尾静脉注射肾毒性血清建立抗GBM肾炎模型,动态监测小鼠肾功能和肾脏病理学改变,并用流式细胞术、ELISA、RT-PCR等方法检测脾脏、血液以及肾脏局部免疫细胞、炎症因子或炎症细胞转录因子随时间的变化来了解小鼠免疫进程;其次利用RT-PCR对C57BL/6小鼠抗GBM肾炎模型和自发系统性红斑狼疮小鼠模型(MRL/Mp J-Fas lpr/J小鼠)肾组织USP25进行检测研究USP25转录表达水平与各类新月体肾炎的关系。接着,利用USP25基因敲除鼠建立抗GBM肾炎模型,在排除USP25基因缺失对小鼠生长、免疫器官、免疫细胞发育影响的情况下,检测USP25-/-小鼠抗GBM肾炎模型不同时间点肾功能(血肌酐、尿素氮),病理改变,脾脏免疫细胞水平(流式细胞术),外周血清炎症细胞因子IFN-g、IL4、IL17A的水平(ELISA)以及肾脏局部辅助性淋巴细胞特征性转录因子(T-bet、GATA3、FOXP3、RORγt)m RNA水平,并与抗GBM肾炎野生小鼠进行比较,探究USP25对抗GBM肾炎免疫进程的具体影响和作用。最后,提取小鼠脾脏淋巴细胞,使用磁珠分选装置分选na?ve CD4+T细胞,将分离到的CD4+T淋巴细胞在96孔细胞培养板内施以相应的刺激使其分别向Th1、Th2、Th17细胞分化,然后使用流式细胞仪检测是否诱导成功;建立稳定诱导条件后对比野生小鼠和USP25-/-小鼠CD4+T淋巴细胞定向诱导分化增殖能力,探究USP25对CD4+T淋巴细胞分化的影响;其次,对分选得到的野生小鼠和USP25-/-小鼠CD4+T细胞活化增殖,利用RT-PCR检测各组Th1、Th2和Th17细胞特征性转录因子T-bet、GATA-3和RORγt的m RNA水平,探究USP25是否通过改变转录因子水平影响其定向分化;最后定向诱导野生小鼠CD4+T淋巴细胞向Th17细胞分化然后检测其USP25蛋白的表达情况,明确Th17细胞分化与USP25之间的关系。结果与正常小鼠相比,抗GBM肾炎模型小鼠血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)在第14天开始升高,并显著高于正常小鼠;对脾脏淋巴细胞检测结果显示在21天内Th1、Th2淋巴细胞的表达比例呈逐渐增加的趋势,而Th17细胞呈先增加后下降的变化趋势,峰值在肾炎反应的第14天左右;血清IFN-g、IL-4、IL-17A水平在第7天时与对照组无显著性差异,第14天和21天时显著高于对照组水平,总体上看IFN-g、IL-4、IL-17A水平在第7天、第14天和21天呈不断增加的趋势;在肾组织局部,随着肾炎进展,Th1细胞、Th2细胞,Treg细胞的转录因子T-bet、GATA3和FOXP3高于对照组水平,呈先升高后下降的趋势,在第14天左右达峰值,Th17细胞特征性转录因子RORγt水平第7天左右即达到最高值,然后不断下降。针对USP25 m RNA水平检测显示,抗GBM肾炎模型小鼠在肾炎发生后USP25m RNA水平高于对照组小鼠,并呈先升高后下降的趋势,而MRL/Mp J小鼠和Faslpr小鼠USP25 m RNA水平均随时间增加而升高,且Faslpr小鼠USP25m RNA水平均高于同周龄的MRL/Mp J小鼠,差异具有显著性。在USP25基因敲除鼠中检测到Scr水平在肾炎模型第14天时显著高于野生肾炎小鼠,BUN在肾炎模型第14天和21天显著高于野生肾炎小鼠。USP25-/-肾炎小鼠脾脏Th1细胞和Th17细胞浸润较野生肾炎小鼠增加,Th2淋巴细胞浸润则无明显改变;外周血液IFN-g、IL-4、IL-17A水平与野生肾炎小鼠没有统计学显著性;肾脏Th17细胞的特征性转录因子RORγt高于野生肾炎小鼠,而Treg细胞的特征性转录因子FOXP3在USP25-/-肾炎小鼠低于野生型肾炎小鼠,Th1细胞和Th2细胞的特征性转录因子T-bet、GATA3在两组小鼠中无显著差异。体外实验中,成功从脾脏淋巴细胞中分选出CD4+T淋巴细胞,然后在体外刺激诱导使其分别向Th1、Th2、Th17细胞分化,结果发现野生小鼠细胞诱导组与USP25-/-小鼠细胞诱导组CD4+T淋巴细胞向Th1细胞和Th2细胞定向分化阳性细胞比例无差异性,而Th17阳性细胞比例在USP25-/-小鼠CD4+T淋巴细胞刺激组中显著增高。对野生小鼠和USP25-/-小鼠CD4+T细胞活化增殖,检测到RORγt m RNA水平在USP25-/-小鼠细胞组中较高,而T-bet、GATA-3 m RNA水平在两组间无明显差异。野生小鼠CD4+T淋巴细胞定向诱导向Th17细胞分化后检测其USP25蛋白水平发现比对照组增高。结论CD4+T细胞免疫应答在抗GBM肾炎早期以Th1和Th17细胞为主要免疫反应细胞,随着疾病进展,肾脏Th17细胞水平先于Th1细胞开始下降,外周炎症细胞因子浓度则持续升高;USP25在体内实验中能减轻抗GBM肾炎进程中的肾组织病理和功能损伤,其机制主要是通过改变Th17细胞和Treg细胞之间的平衡状态促进免疫耐受,同时可负调节外周免疫器官促炎细胞Th1和Th17的分化增殖,减轻全身炎症反应;在体内和体外实验中,USP25可抑制na?ve CD4+T细胞向Th17细胞分化,其作用机制可能与下调RORγt有关;当机体炎症反应增加或Th17细胞分化增加时,可激活USP25表达形成负反馈调节通路减弱免疫激活。