胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难且预后极差。五年生存率不及5%。尽管近年来随着生物医学研究的发展，临床诊疗有适当的改善，但是胰腺癌的诊断治疗并未有根本的进展。2010年美国有44,030名患者诊断为胰腺癌，37,660死于该恶性肿瘤，几乎发病率等于死亡。目前手术是唯一治愈胰腺癌的方法，但仅约5%-10%的患者有手术机会，手术后还可能复发。因此迫切需要开发胰腺癌的早期诊断标志物及新的治疗靶点。随着人类基因组计划的完成，全基因组测序技术开创了新的分子医学研究领域，对个体化诊疗及疾病的预后具有里程碑式的意义。为一线科研工作者研究疾病的发病机制提供强有力的研究武器。目前全基因组测序已发现20,000-25,000基因，3亿个碱基对和大量的突变及单核苷酸多态性（SNPs）。但是，随着海量基因组数据的产生，如何高效的进行数据分析并指导临床是目前面临的主要挑战。近10年基因组测序技术有了长足的发展，新一代基因组测序技术不仅其测序周期明显缩短，测序费用显著降低，而且对全基因组范围的表观遗传学和转录组学等进行了深入研究。随着后基因组时代的来临，未来将对基因组表达调控及编码蛋白所产生功能进行深入研究，有利于阐述疾病的发病机制，为临床应用打下坚实基础。肿瘤是一种基因异常性疾病，异常基因表达导致其编码蛋白质功能异常，最终损伤细胞的功能产生疾病。因此，全基因组测序有助于深入研究胰腺癌的发病机制，在不久的未来，指导个体化治疗。研究证实许多基因突变，如：KRAS，SMAD4，CDKN2A (p16)和TP53(p53)，密切参与胰腺癌的发生发展。深入研究这些基因突变的功能可进一步明确胰腺癌的发病机制及有助于开发胰腺癌诊断标记物和治疗靶点。近年发现一些新的胰腺癌相关基因。比如过表达ZIP4和PDX-1促进胰腺癌的生长。我们以前的现就发现胰腺癌组织中ZIP4存在过高表达，进一步体内及体外实验证实沉默ZIP4表达可减缓胰腺癌细胞的生长和延长胰腺癌模型小鼠的生存期。有实验表明PDX-1也是一种致癌基因，在胰腺癌中高表达。目前的研究显示ZIP4和PDX-1是新的胰腺癌靶点，对胰腺癌的发生及进展起重要作用。因此，深入细致地研究这些基因的基因表达谱有助于研究胰腺癌的发病分子机制。动物模型，尤其是小鼠动物模型，经常用于科研模拟疾病发生发展等情况。Panc02和Panc02-H7是两株C57BL/6小鼠胰腺癌细胞株，Panc02-H7衍生于Panc02细胞株，且较Panc02具有较高的转移潜力，动物模型表明其生长及其快，而且非常容易转移至腹腔或其他脏器，如肝和肺等，经常用于胰腺癌转移机制及治疗等研究。也经常用于胰腺癌的免疫机制研究及胰腺癌免疫治疗等的研究。基于以上研究现状，本研究在小鼠胰腺癌细胞株及C57BL/6小鼠正常胰腺组对胰腺癌转移相关基因进行外显子测序，试图鉴定出导致小鼠胰腺癌细胞株胰腺癌转移生物学性状差异如此明显的驱动基因，并进一步对其功能进行验证。我们重点关注ZIP4，并在配对胰腺癌组织，正常胰腺组织和血清中利用基因组测序技术对ZIP4进行测序。因此，本研究分以下两部分：1.小鼠胰腺癌转移相关基因外显子测序及致病突变作用机制研究目的：通过对胰腺癌相关基因测序，探索导致小鼠胰腺癌转移生物学性状差异明显的原因。方法：我们设计一系列引物涵盖KRAS，SMAD4，CDKN2A(p16)，TP53(p53)，ZIP4和PDX-1基因的外显子，并对小鼠胰腺癌细胞株的这些基因进行测序；测序结果以正常小鼠胰腺组织的序列和NCBI公布的序列为参照利用Sequencher v4.7软件进行比对分析；利用Real Time PCR和Western Blot分析该突变基因的RNA和蛋白质表达；用点突变技术构建突变质粒，转染细胞后进行荧光酶素分析，验证突变基因的功能。结果：（1）测序序列比对分析结果显示在小鼠胰腺癌细胞株Panc02、Panc02-H7和C57BL/6均在K-ras基因32密码子第三位碱基由TAT转换为TAC，但并不引起所编码氨基酸的改变。（2）小鼠胰腺癌细胞株Panc02和Panc02-H7存在SMAD4基因无义突变，即174密码子GAA＞TAA。其导致SMAD4基因翻译时SMAD4蛋白质提前终止，且突变位于SAMD4蛋白的连接区，其导致失去SMAD4蛋白的MH2功能区域。（3）这些胰腺癌细胞中无CDKN2A(p16)，TP53(p53)，ZIP4和PDX-1基因突变。（4）Western Blotting蛋白表达分析显示野生型SMAD4人胰腺癌细胞株Panc-1有一明显条带，而突变型SMAD4小鼠胰腺癌细胞株未见蛋白条带。Real-time PCR显示两细胞均表达内源性SMAD4RNA。（5）SAMD4突变功能验证人胰腺癌细胞株Panc-1结果显示无论转染野生型SMAD4还是突变型SMAD4，Panc-1对TGF-β均有相似的反应；小鼠胰腺癌细胞株Panc-02结果显示此细胞株本身或转染了突变型SMAD4后此细胞并未对TGF-β的刺激发生反应；而转染了野生型SMAD4后该细胞株对TGF-β的刺激有应答反应；在Panc02-H7细胞株中，无论转染野生型还是突变型SMAD4,该细胞均未对TGF-β的刺激作出明显的应答反应。结论：本研究在小鼠胰腺癌细胞株Panc02、Panc02-H7中发现的SMAD4突变导致SMAD4截断性蛋白，进一步功能验证显示两株小鼠胰腺癌细胞株的TGF-β-SMAD信号通路功能不同，这可能参与胰腺癌的转移机制。我们还发现一KRAS SNP（32密码子TAT＞TAC），氨基酸序列并未改变，我们认为这是KRAS基因的一种SNP。氨基酸序列并未改变，可能其不会引起KRAS基因功能异常可。2.胰腺癌ZIP4基因组测序目的：探索ZIP4在胰腺癌发病中是否存在致病基因突变方法：利用ABI3700测序仪对配对胰腺癌组织、正常胰腺组织及血清中的ZIP4进行基因组测序。通过比对分析胰腺癌组织与正常胰腺、血清中的ZIP4外显子序列来整合这些结果。利用人类基因组测序中心的自动分析技术识别突变。并人工再次确认。结果：总共发现17个SNPs，其中有7个SNPs是我们新发现的。有3个SNPs位于启动子，4个位于内含子，10个位于外显子。在这10个位于编码区的SNPs中，3个是同义突变，7个属于非同义突变（Thr19Met，Ala58Thr，Pro84Leu，Ala114Thr，Glu284Lys， Thr357Ala和Pro484Ser）。因为rs2280838（Ala58Thr），rs17855765（Ala114Thr）和rs2272662（Thr357Ala）是位于外显子的非同义突变，其可能与胰腺癌的发病机制相关。结论：明确了胰腺癌ZIP4的基因组背景。需要进一步对SNPs进行功能验证，尤其是rs2280838（Ala58Thr），rs17855765（Ala114Thr）和rs2272662（Thr357Ala）。以及在大样本量的患者人群中进行相关性分析。通过以上研究，本课题得出以下结论：1.通过对小鼠胰腺癌细胞株中KRAS，SMAD4，CDKN2A (p16)，TP53(p53)，ZIP4和PDX-1基因进行外显子测序，发现一个KRAS SNP和一个SMAD4突变，其中SMAD4基因突变导致SMAD4蛋白MH2功能区域的功能完全丧失。2.SMAD4突变功能验证研究证实该突变导致TGF-β信号通路异常。3.小鼠胰腺癌细胞株Panc02和Panc02-H7的TGF-β信号通路异常情况不完全一致，在Panc02细胞中SMAD4突变可完全阻断TGF-β信号通路的活化；在Panc02-H7细胞株中TGF-β信号通路的失活化不是由于SMAD4突变导致，可能存在其他TGF-β信号通路成员（SMAD2/3）的异常表达或突变。4.人胰腺癌基因组测序研究未发现ZIP4突变，部分SNPs可能与胰腺癌相关，需要进一步研究和验证。总之，SMAD4和ZIP4密切参与胰腺癌的发生发展，基于基因组测序方法检测其在胰腺癌中的异常情况，可协助对胰腺癌致病机制的理解。