牛乳脂肪的主要成分是甘油三酯（Triglyceride,TAG）,是最接近母乳的营养成分,具有便于肠胃吸收,利用率高的优点。泌乳奶牛乳脂肪合成受多种基因表达的调节。PLIN基因家族是一类功能高度保守的脂类代谢相关蛋白,通过与脂滴特异性结合参与脂类代谢的调节。为研究PLIN家族与奶牛泌乳之间的关系,首先采用RT-PCR方法检测了PLIN家族5个成员在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织的表达模式,结果显示PLIN3 m RNA在泌乳期奶牛乳腺组织中的表达显著高于干奶期,PLIN2 m RNA在奶牛乳腺组织中表达,但泌乳期同干奶期相比m RNA水平未发生显著变化,而PLIN1、PLIN4和PLIN5 m RNA在奶牛乳腺组织中未检测到,该结果提示在PLIN家族各个成员中,PLIN3的表达可能与奶牛泌乳相关。采用western blot方法检测PLIN3蛋白在不同生理时期奶牛乳腺组织中的表达,结果也显示PLIN3蛋白的表达在泌乳期奶牛乳腺组织中显著高于干奶期。免疫荧光的方法检测PLIN3在奶牛乳腺组织中的表达部位,结果显示泌乳期乳腺上皮细胞中具有丰富的乳脂滴,PLIN3主要在乳脂滴富集的乳腺腺泡上皮细胞中检测到,提示PLIN3可能参与泌乳奶牛乳乳脂合成的调节。为进一步验证PLIN3的表达与奶牛乳脂合成的关系,采用基因过表达和基因沉寂的方法改变奶牛乳腺上皮细胞中PLIN3的表达水平。TAG检测结果显示PLIN3过表达后奶牛乳腺上皮细胞中TAG含量显著上升,脂滴数量增多;PLIN3沉寂后,细胞内TAG含量下降。该结果表明PLIN3可以正向调节乳脂合成。油酸是牛奶中主要的十八碳不饱和脂肪酸。有研究表明在日粮中添加含有油酸的成分饲喂奶牛,能改变乳脂中的脂肪酸组成,提高乳脂产量。为研究油酸对奶牛乳腺上皮细胞中乳脂合成的影响以及PLIN3是否介导这一过程,首先在无脂无血清的培养液中添加100μm/L油酸对乳腺上皮细胞进行刺激,TAG含量测定结果显示添加油酸可以显著提高奶牛乳腺上皮细胞中的TAG水平。RT-PCR结果显示油酸可以诱导PLIN2和PLIN3 m RNA的表达上调,但是没有检测到PLIN1、PLIN4、PLIN5的m RNA表达。Western blot结果也显示油酸处理可以使奶牛乳腺上皮细胞中PLIN3蛋白表达增加。在添加油酸的基础上对PLIN3基因进行沉寂,油酸对乳脂合成的诱导作用被抑制。使用Bodipy标记奶牛乳腺上皮细胞中的脂滴,采用激光共聚焦显微镜观察油酸处理0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h以及24 h时PLIN3与细胞内脂滴的定位情况,结果显示添加油酸后脂滴开始生成,并随着处理时间的增加脂滴数量变多,体积变大,PLIN3始终定位于小的脂滴表面,在大脂滴表面没有观察到PLIN3的表达。这些结果表明PLIN3参与奶牛乳腺上皮细胞中脂滴的初生成过程。mTOR信号通路可以感知细胞中营养信号的刺激。研究表明短链脂肪酸可以激活mTOR信号通路调节乳脂的合成。为进一步研究mTOR信号通路是否可以被油酸激活,介导油酸对PLIN3的表达及乳脂合成的调节,在油酸诱导的奶牛乳腺上皮细胞培养液中添加mTOR抑制剂雷帕霉素,结果显示雷帕霉素抑制了mTOR及其下游信号通路分子的激活和PLIN3的表达,同时油酸诱导的TAG合成也被抑制。而当在雷帕霉素抑制的条件下采用基因过表达的方法恢复奶牛乳腺上皮细胞中PLIN3的表达水平,乳脂合成可以被恢复。这些结果表明油酸可以通过激活mTOR信号通路调节PLIN3蛋白的表达,进而调节乳脂合成。综上所述,PLIN3的表达与奶牛泌乳过程相关,PLIN3可以促进奶牛乳腺上皮细胞中乳脂的合成,在奶牛乳腺上皮细胞中,油酸通过mTOR信号通路调节PLIN3的表达,进而调节乳脂的合成。该研究结果明确了PLIN3在泌乳奶牛乳脂合成过程中作用,可以为完善奶牛乳脂合成基因调控网络提供理论研究基础。