论文部分内容阅读
背景:重症肌无力（Myasthenia Gravis,MG）是一种难治性的神经系统疾病,当前虽然有多种治疗药物相继问世,但仅能缓解临床症状,并且药物所带来的不良反应如激素的依赖性以及停药反应等问题仍亟待解决。长期以来的临床实践证明,中药在MG的治疗中发挥着难以替代的作用,不仅能够缓解临床症状,减少病情反复,而且对服用西药的患者能够减药甚至停药,减少了西药毒副作用。目前对于MG的病因病机多认为是脾肾亏虚贯穿始终,且导师黄春华及饶旺福主任在临床治疗中使用益气温肾法取得较好疗效,因此益气温肾法治疗MG值得我们进一步深入研究。目的:本研究首先通过挖掘近十年来中药治疗MG的相关文献,探索其用药规律;其次对益气温肾法治疗MG进行网络药理学分析,从成分-靶点-通路等方面来阐述其潜在作用机制。最后通过临床试验对比益气温肾法治疗前后的临床绝对评分和中医证候评分评估临床疗效;比较T淋巴细胞亚群水平治疗前后的变化,初步探讨益气温肾法对免疫指标的调控作用。方法:1.搜集整理中国知网、万方、维普以及中国生物医学数据库中近10年公开发表的有关中药治疗MG的文献,提取处方至Excel 2019中进行数据预处理,计算每味中药使用频次以及所涉及药物的功效、性味、归经。运用SPSS Modeler15.0进行矩阵分析及关联规则分析,将其结果导入至Cytoscape 3.7.2软件中进行中药网络可视化操作。2.利用TCMSP平台获取益气温肾法中10味中药入血后的有效活性成分和相应的药物靶点,使用Uniprot数据库获得对应的人源靶点;利用Drugbank、Gene Card、OMIM和TTD数据库获取与MG相关的靶点,药物-疾病的交集靶点即有可能是益气温肾法发挥治疗作用的潜在靶点。借助STRING数据库及Cytoscape插件绘制PPI蛋白互相作用网络,并获取益气温肾法发挥治疗作用的关键基因。将靶点导入至Clue Go插件及Metascape数据库中进行GO、KEGG富集分析,利用Auto Dock及Pymol软件对关键活性成分及获得的关键靶点进行分子对接。3.收集2019年9月至2021年9月就诊于江西中医药大学附属医院导师脑病科门诊及国医堂饶旺福教授门诊以益气温肾法治疗的MG患者资料,利用SPSS 25.0软件对治疗前、治疗6月后的临床绝对评分、中医证候评分、T淋巴细胞亚群水平（CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+）进行检测分析。在治疗过程中及时询问患者西药（胆碱酯酶抑制剂或激素等）的减停情况,并及时做好记录,眼肌型患者在治疗1年后进行随访了解临床转归情况。结果:1.数据挖掘研究:最终共纳入中药治疗MG的文献267篇,其中涉及274首方剂,226味中药,高频药物包括黄芪（241次,87.96%）、白术（209次,76.28%）、当归（181次,66.06%）、甘草（173次,63.14%）、升麻（170次,62.04%）等。功效分布上以补虚药（1664次,49.63%）、解表药（479次,14.29%）、活血化瘀药（205次,6.11%）、理气药（187次,5.58%）、清热药（160次,4.77%）、利水渗湿药（15次,4.53%）为主。药性以温性药、寒性药、平性药居多,频数频率分别为80次（35.24%）、77次（33.92%）和53次（23.35%）;药味以甘味（121次,32.70%）、苦味（107次,28.92%）和辛味（84次,22.70%）为主。药物主要集中在肝经（126次,22.50%）、脾经（83次,14.82%）和肾经（79次,14.11%）,占总频数的51.43%;共获得以黄芪为核心得24条药物关联规则:如黄芪-白术,黄芪-升麻,黄芪-升麻、白术,黄芪-当归、白术,和黄芪-柴胡等。2.网络药理学研究:益气温肾法中共筛选有效活性成分85种,其中度值最高的化合物为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、木犀草素和异鼠李素。益气温肾法的作用靶点有260个,MG靶点823个,交集靶点有55个,其中AKT1、IL-6、TP53、VEGFA及TNF可能发挥主要作用。KEGG富集分析益气温肾法治疗MG主要涉及IL-17、TNF、PI3K-Akt及T细胞受体等信号通路;分子对接结果显示,所有对接结果的最低结合能均＜-5 k J·mol-1,整体体现出较好的结合能力,从小分子与靶点相互作用方面证实了网络关键节点的可靠性。3.临床试验研究:益气温肾法治疗MG患者疗效显著,治疗6月后西医、中医临床有效率分别达83.12%和87.01%,并且临床绝对评分及中医证候评分均有所下降（P＜0.05）。治疗前、后T细胞亚群水平对比结果显示CD4+T、CD4+/CD8+比值有所下降（P＜0.05）,CD8+T数值较前有所升高（P＞0.05）。治疗过程中西药均在逐渐减量,且以胆碱酯酶抑制剂为主。在治疗1年后对眼肌型患者进行随访研究其转归情况,结果发现有6名患者转为全身型,5例患者痊愈以儿童和青少年为主。结论:1.MG的治疗以补虚药为主,与肝、脾、肾等脏器密切相关,治疗上应以健脾、益气、升阳、温肾等为大法。然而从药物分析来看,提示补中益气汤的8味药物发挥主要治疗作用,仍有待创新。2.益气温肾法治疗MG是多成分、多靶点、多途径共同参与的,主要成分包括槲皮素、山奈酚、豆甾醇等,核心靶点包括AKT1、IL6、TP53等,主要通路包括IL-17、TNF、PI3K-Akt及T细胞受体等信号通路,其结论仍需要进一步的基础实验验证。3.益气温肾法治疗MG确有疗效,能够缓解患者临床症状,改善淋巴细胞亚群免疫功能（CD8+T虽无统计学意义,但数值有上升的趋势）,由于时间限制纳入样本量较少,今后的研究应进行多中心、大样本、多地域,更加规范严谨的临床研究,丰富检测指标如血清抗体的检测。对于西药依赖型患者在服用中药治疗期间待病情稳定后逐渐减少西药用量,减轻毒副作用。对于眼肌型患者最主要的目的不仅是缓解症状,而是通过中药治疗阻止或延缓向全身型发展,而其最终效果需要长时间病例收集、跟踪和随访。