论文部分内容阅读
目的:1)为了阐明胆汁酸盐对细粒棘球绦虫生长发育的影响,采用含胆汁酸盐的培养基培养细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）原头蚴（Protoscolex,PSC）诱导其向成虫发育,观察不同时间段的发育状态;2)利用生物信息学软件分析细粒棘球绦虫内联蛋白（Eg Innexin unc9,Eg Inx）的分子特性及其功能;3)克隆Eg Innexin unc9基因并通过原核表达系统进行蛋白表达和制备多克隆抗体;4)确定Eg Innexin unc9在细粒棘球绦虫的表达部位和不同发育阶段的表达情况,为包虫病控制提供依据。方法:1)配置成虫培养基和成囊培养基,平行添加不同类型的胆汁酸盐（胆盐）,采用含不同种类的胆盐培养基平行进行PSC培养,对比分析PSC外翻率和发育状态;利用牛磺胆酸钠（T4009）单相培养基进行成虫培养;2)采用Expasy Prot Param、Prot Scale、Signal P-5.0、TMHMM2.0、Net Phos3.1、Prot Compv9.0、MEME、Net Surf P-2.0和SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学分析软件对Eg Innexin unc9氨基酸序列进行分析预测其理化特性和结构;3)通过PCR技术扩增Eg Innexin unc9基因全长及其ORF序列并测序;利用原核表达系统及密码子优化技术对Eg Innexin unc9序列进行表达优化并合成其优化基因序列;通过双酶切Nde I/Hind III构建重组质粒p ET30a-Eg Innexin并进行测序,将测序正确的重组质粒转染到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达重组蛋白,检测表达蛋白并进行纯化;4)用纯化的重组蛋白Innexin unc9免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western Blotting检测抗体对重组蛋白和虫体蛋白的识别;5)免疫组化定位Eg Innexin unc9蛋白在虫体表达的组织部位;6)通过q RT-PCR和Western Blotting检测体内和体外不同发育阶段Eg Innexin unc9的表达情况。结果:1)采用含不同胆盐的培养基进行平行培养,连续培养原头蚴35 d,随着时间的变化,在不同的时间节点其外翻情况不同,在10 d以后,无胆盐培养基中的PSC外翻率急剧下降,25 d之后胆盐组的PSC外翻率明显高于无胆盐组,培养到35 d,无胆盐培养基中的PSC发育为包囊或死亡,含T4009或犬胆汁培养基的PSC外翻率都较高;2)细粒棘球绦虫PSC向成虫方向培养结果显示,部分PSC向成虫方向发育,其中一部分发育到两个节片,有些存在畸形,只有少部分可以长到3-4个节片,但是体外成虫培养周期比体内时间长,且成虫率不高;3)通过生物信息学软件预测显示Eg Innexin unc9编码的蛋白含438个氨基酸（Aa）残基,其分子量是49.41KDa,为不稳定且疏水性蛋白,该蛋白定位于细胞膜,存在四个跨膜区和多个B细胞表位,预测其模体（motif）氨基酸特征序列为Y/PYQWVP,其二级结构主要以α-螺旋为主;4)PCR扩增Eg Innexin unc9基因全长及其ORF序列,基因全长是1387 bp,ORF全长为1317 bp,测序鉴定后通过序列优化构建重组质粒p ET30a-Eg Innexin unc9并在原核表达系统进行重组蛋白诱导表达,表达的重组蛋白分子量大小为42KDa左右,纯化该重组蛋白并免疫动物获得含抗体的血清,纯化抗血清得到多克隆抗体,经实验验证可以特异性识别原头蚴和成虫蛋白,其条带存在单聚体、二聚体和五聚体,分子量分别为42KDa、84KDa、210KDa,而生发层蛋白呈现非特异性条带;5)组织学定位结果显示,PSC在培养前,Eg Innexin unc9蛋白定位在其体表皮层周围的钙颗粒,经过培养30min后,特别是在含有胆盐的条件下,其大量定位在体表皮层和头节位置,无胆盐组主要是在皮层表达;在犬体内35 d成虫4个节片阶段,该蛋白主要表达于孕节和生殖系统;6)q RT-PCR结果显示,与体内刚采集的PSC相比,Eg Innexin unc9基因在体内生发层（GL）和成虫（Ad）表达都较低（P＜0.05）,在GL和Ad的表达无统计学差异（P＞0.05）;在体外培养的不同发育阶段,与其他时间段相比,在培养30min时表达量较高,且培养T4009组表达量高于平行无T4009组,且具有统计学意义（P＜0.05）,培养到17d时,观察到同样的结果;Western Blotting和q RT-PCR结果一致。结论:本研究成功克隆出了Eg Innexin unc9的基因全长及其ORF序列,且构建了重组表达载体并表达了其重组蛋白,重组蛋白经过纯化后免疫动物并制备了多克隆抗体,具有较高的效价和特异性。对于该基因的表达,通过比较体内不同发育阶段的原始样本,发现其在PSC的表达水平均高于生发层和成虫;比较体外有无胆盐平行培养的原头蚴,发现在培养30 min和17 d时胆盐组表达水平均高于平行无胆盐组,差异具有统计学意义;该蛋白在有胆盐培养的PSC主要定位在体表皮层和顶突,在35 d体内成虫定位在孕节和生殖系统。以上提示在胆盐环境下,Eg Innexin unc9在关键时间点表达升高可能参与调控细粒棘球绦虫的生长发育。