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癌干细胞（Cancer stem cells,CSCs）是肿瘤组织中具有干细胞特性的亚群细胞,细胞周期进展缓慢,具有放化疗抵抗性和高度自我更新能力,是肿瘤复发、转移及预后不良的根源。因此,CSCs的靶向干预成为治疗癌症的新策略。原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一,其预防与治疗一直是临床科学家面临的巨大挑战。此外,临床关于肝癌组织的切片表明针对干细胞相关标记的免疫组化实验都显示肝癌组织中具有表达干细胞相关标志物的亚群细胞。研究人员在体外从各种肝癌细胞系中分离出肝癌干细胞（Liver cancer stem cells,LCSCs）,进一步证明了肝癌中存在肝癌干细胞。研究发现,力学因素（基质刚度、剪切力等）不仅在调控癌细胞恶性转化的关键环节中起重要作用,而且可诱导间质样细胞获得肿瘤起始或干细胞样功能从而推动癌症发展,参与干细胞干性、增殖、迁移等生物学行为调节,同时还可诱导上皮细胞呈现恶性转化的特征,促进其表达干细胞标志分子,显示力学因素可能是癌干细胞形成的一个关键驱动因素。先前的研究发现,肿瘤组织中侵袭前沿区域的杨氏模量比核心区域更高,并且异质性更高。更重要的是,CSCs在癌组织中的分布不均匀。在肝癌组织中,LCSCs高度集中在侵袭前沿区域,与肝癌组织的力学差异性呈正相关。因此,为了探索基质刚度与LCSCs干性之间的关系。我们旨在在体外建立一个简单但有效的三维（3D）系统,以模拟肝癌组织的硬度。海藻酸钠（Sodium alginate,SA）水凝胶具有低毒性和优越的生物相容性,已被广泛应用于生物医学材料中。特别是,可以使用氧化剂进行氧化,以降低SA的分子量并提高生物降解性。本文制备了两种刚度的氧化海藻酸钠（Aldehydatedsodium alginate,ASA）水凝胶:7.7 k Pa和72.2 k Pa,分别模拟肝癌组织核心区域和侵袭前沿区域组织的刚度。以从人肝癌细胞系HCCLM3富集得到的LCSCs为研究对象,探究了在3D水凝胶中,基质刚度与肝癌干细胞干性之间的关系。本课题的主要研究内容及结果如下:（1）LCSCs的富集与鉴定利用DMEM/H培养基培养肝癌细胞HCCLM3,采用体外肿瘤球富集法从HCCLM3细胞富集得到球体细胞,进行干性鉴定。结果显示:富集得到的细胞具有很好的成球能力;与HCCLM3细胞相比,球体细胞的干性相关基因c-Myc、Oct4和干细胞表面标志物CD133、CD44、Ep CAM的表达显著上调;球体细胞具有更强的克隆球形成能力、耐药能力及裸鼠体内成瘤能力。结果表明:富集得到的球体细胞具有肿瘤干细胞表型,符合肿瘤干细胞的特征。（2）3D水凝胶的制备与表征通过高碘酸钠（Na IO4）对SA进行氧化获得ASA,利用ASA与不同浓度的氯化钙（Ca Cl2）反应,制备不同刚度的水凝胶。傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）分析结果显示海藻酸钠被氧化。万能力学拉伸仪检测结果发现不同浓度的Ca2+与氧化海藻酸钠能形成不同刚度的水凝胶,并且刚度随着Ca2+浓度的增加而增大。不同刚度的氧化海藻酸钠水凝胶具有良好的稳定性和细胞相容性。结果说明:氧化海藻酸钠水凝胶适合用于培养LCSCs。（3）基质刚度对LCSCs干性的影响将LCSCs接种在两种刚度的ASA水凝胶中,第8天时溶解水凝胶获得细胞,检测基质刚度对LCSCs干性的影响。结果显示:LCSCs均能在两种刚度水凝胶中成球,高基质刚度培养的LCSCs具有更强的增殖能力;与低基质刚度培养的LCSCs相比,高基质刚度培养的LCSCs的干性相关基因c-Myc、Oct4和干细胞表面标志物CD133、CD44、Ep CAM的表达显著上调;高基质刚度培养的LCSCs具有更强的克隆球形成能力、耐药能力和裸鼠体内成瘤能力。结果说明:基质刚度可以调控LCSCs的干性。（4）基质刚度通过Yes相关蛋白（Yes-associated,YAP）调控LCSCs的干性YAP是力敏感因子和力转导因子,能将外界力学刺激转化为细胞内的生物化学信号调控细胞的生物学行为。通过q-PCR检测YAP的m RNA水平表达,western blot检测总的YAP和磷酸化YAP（p-YAP）的表达情况。结果显示:与低基质刚度培养的LCSCs相比,高基质刚度培养的LCSCs中的总YAP表达显著上调,而p-YAP/YAP的比值显著下调。此外,通过q-PCR检测YAP的下游靶基因CTGF和CYR61的表达。结果显示:高基质刚度培养的LCSCs中CTGF和CYR61的表达显著增加。为了确定YAP在基质刚度对LCSCs干性调控中的作用,利用YAP的抑制剂（Verteporfin,VP）处理后通过western blot检测YAP的表达情况及LCSCs的干性变化。结果显示:YAP的抑制剂能显著抑制LCSCs中干性相关基因和干细胞表面标志物的表达。上述结果表明:基质刚度通过YAP信号调控LCSCs的干性。综合上述结果表明,在3D培养条件下,基质刚度通过上调YAP的表达促进LCSCs的干性。本研究为LCSCs的3D培养提供了一个简单有效的平台,为深入了解基质刚度在调控LCSCs干性中的作用及其力学生物学机制提供了实验依据和方法学参考,为临床上肝癌的力学靶向治疗提供了实验指导。