早期研究表明RNA分子负责细胞的多种功能,包括遗传信息的转录和翻译,分子作用元件的结构性支撑,调控基因表达或沉默及催化功能等。掌握RNA的动态迁移,包括实时定位、起点和终点,有助于我们研究细胞在健康和疾病状态下的行为和功能,加深对RNA的认识。人们开发了多种RNA成像技术,应用于RNA的亚细胞定位成像。RNA原位杂交（FISH）作为主流的RNA成像系统,实现了高分辨率的RNA亚细胞成像,但RNA FISH需要固定细胞进行成像,难以对活细胞RNA进行追踪。近年来随着CRISPR技术的不断发展,一类专一靶向切割RNA的Cas13家族蛋白被发现。将Cas13蛋白RNA核酸酶失活后,可以靶向结合RNA,因此被应用于活细胞RNA成像。基于此开发了d Lwa Cas13a-NF和d Psp Cas13b-FP等RNA活细胞成像系统,然而这些系统中存在游离的荧光蛋白导致未聚集m RNA成像背景荧光较高且成像分辨率较低的缺陷。因此本研究基于Cas13蛋白靶向结合RNA原理,利用d Lwa Cas13a蛋白作为靶向目标RNA的追踪器。d Lwa Cas13a融合24×Sun Tag多肽负责招募大量荧光蛋白Venus。被招募的Venus荧光蛋白应用互补荧光蛋白技术分裂为两部分,当两部分结合重新激发荧光,可减少游离荧光蛋白背景。我们设计这一全新的RNA指示系统,为活细胞RNA成像提供更高分辨率和更低背景的新工具。本研究共包含以下三方面的实验内容。第一部分实验中,我们设计并构建了d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统。并该系统与RNA FISH技术在同一细胞内对Ppib m RNA标记并进行共定位分析,结果显示d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统在活细胞可准确定位Ppib m RNA,并且不影响其m RNA的转录。进一步,将该系统与早期的d Lwa Cas13a-NF系统进行了比较,结果表明d Lwa Cas13a-NF在sg RNA引导下,相较于无sg RNA对照组,其标记m RNA从细胞核转运细胞质效率没有明显提升,这可能到会导致RNA成像假阳性表型。相比较之下,d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统在sg RNA引导下,其标记m RNA从细胞核转运细胞质效率相较于无sg RNA对照组提升了约2倍。第二部分实验中我们针对荧光背景、成像分辨率和细胞核RNA定位三方面,优化了d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统。筛选出了最佳的Venus荧光蛋白、Sun Tag数量和核定位信号数量,成功构建了用于对细胞质和细胞核RNA的d Lwa Cas13aSun Tag-Bi FC系统。实验结果显示24×Sun Tag的成像分辨率是2×Sun Tag的成像分辨率的5倍。此外,在d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统中应用4个核定位信号实现对Xist细胞核RNA的准确定位。第三部分实验中,我们将d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统在细胞内进行了示踪的应用。其中我们使用d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统标记内源Ppib m RNA,成像了Ppib m RNA与内质网和应激颗粒的共定位,证明了Ppib m RNA能够与内质网和应激颗粒相互作用。另一应用为我们联合d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统与MS2系统,成像了提前终止突变（PTC）在细胞核导致Oxt m RNA外显子跳跃。此外,我们比较了d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统与12×MS2系统标记相同RNA的信噪比,结果表明d Lwa Cas13a-Sun Tag-Bi FC系统信噪比较12×MS2系统提升1.5倍。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas13系统,Sun Tag系统和互补荧光蛋白技术成功构建了具备高分辨率的活细胞RNA成像系统,为RNA活细胞定位和剪切成像提供了一个全新的工具。同时成像了Ppib m RNA的迁移最终聚集于内质网以及Ppib m RNA与应激颗粒结合,为内质网调节m RNA定位和功能提供证据。