【摘 要】
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目的:研究 Hsa-mir-421 是否能够靶向抑制 retinoblastoma-like 2（RBL2）,以及是否能够通过抑制RBL2在细胞中的表达水平来增强肝癌细胞的增殖。方法:从 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和 TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）数据库中选取使用非编码RNA芯片的肝细胞肝癌数据集。对数据集
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目的:研究 Hsa-mir-421 是否能够靶向抑制 retinoblastoma-like 2（RBL2）,以及是否能够通过抑制RBL2在细胞中的表达水平来增强肝癌细胞的增殖。方法:从 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和 TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）数据库中选取使用非编码RNA芯片的肝细胞肝癌数据集。对数据集中miRNA表达量进行分析、筛选,筛选的条件为:logFC（Foldchange）的阈值为0.5,矫正后p值的阈值为0.05。将各数据集中筛选出来的miRNA取交集,然后运用T CGA数据库中的临床数据对筛选出来的miRNA进行COX分析,p值的阈值为0.05。结果显示,在多个肝细胞肝癌的数据集中,miR-421a在肝细胞肝癌组织中的表达量高于周围的癌旁组织。因此,我们选定miR-421a作为研究对象。通过miR Walk2.0预测可能的靶基因,再通过对GEO数据库的分析找出在肝细胞肝癌中表达量减少的靶基因。通过qRT-PCR检测正常肝细胞株L02和三株肝癌细胞株Huh 7,HepG2,SMMC-7721中miR-421a的表达量,我们选择与正常肝癌细胞株差异最为明显的Huh7和HepG2作为参与后续研究的肝癌细胞株。实验将细胞分为Co ntrol 组（转染 Lipofectamine 3000）、NC 组（转染 Lipofectamine 3000+NC 序列）、miR-421a mimics 组（转染 Lipofectamine 3000+miR-421a mimics 序列）、miR-421 a inhibitor 组（转染 Lipofectamine 3000+miR-421a inhibitor 序列）和 rescue 组（转染 Lipofectamine 3000+miR-421a inhibitor 序列+RBL2 siRNA 序列）。我们通过生物信息网站 RNAhybrid（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid）预测 mi R-421a和RBL2的可能的靶向结合位点,并通过荧光素酶报告实验和Western B1 ot实验来证明miR-421a和RBL2的靶向调控关系。我们通过CCK8以及克隆形成实验来检测miR-421a对肝癌细胞株HepG2和Huh7增殖能力的影响。最后我们将通过rescue组来进一步证明miR-421a通过靶向抑制RBL2表达,促进肝癌细胞H epG2的增殖。结果:通过对TCGA和GEO数据库中肝细胞肝癌组织中miRNA表达量的分析、筛选,我们发现miR-421a、miR-1269以及miR-375在肝细胞肝癌组织和癌旁组织中存在明显的表达差异。同时,COX分析的结果显示,这三种miRNA都可以影响患者未来的生存率。由于关于miR-421a在人类肝细胞肝癌中所发挥作用的报道较少,因此我们选择miR-421作为进一步的研究对象。qRT-PCR的结果显示,肝癌细胞株HepG2和Huh7中miR-421a的表达量明显高于正常肝细胞株L02中的表达量（p＜0.05）。双荧光素酶报告实验证明miR-421a与RBL2有明确的结合位点（p＜0.05）。Western blot的结果显示,miR-421a可以负向调控RBL2在蛋白质水平的表达。上调miR-421a后HepG2及Huh7的细胞增殖能力明显增强（P＜0.05）,RBL2的表达量明显下降（P＜0.05）;下调miR-421a后HepG2及Huh7的细胞增殖能力明显被抑制（P＜0.05）,RBL2的表达量明显增加（P＜0.05）。在rescue组,相较于miR-421a inhibitor组,RBL2的表达量下降至与Control相近的水平,肿瘤细胞的增殖能力也被提高至与Control相近的水平（P＜0.05）。结论:相较于癌旁组织,肝细胞肝癌中miR-421a的表达量增加,RBL2的表达量减少。在肝细胞肝癌中mirR-421a通过靶向RBL2的降解,促进肝癌细胞的增殖。
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