菜豆普通花叶病毒(BCMV)致病型分化研究及其侵染性克隆的构建

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菜豆普通花叶病毒(bean common mosaic virus,BCMV)是马铃薯Y病毒属(Poty virus)的成员之一,在世界各地广泛分布,可严重影响豆科作物的产量和品质,造成巨大的经济损失。根据BCMV不同株系对含有不同抗性基因的菜豆(Phaseolus vulg aris Linn.)品种侵染后的生物表型不同,可将BCMV致病型划分为PG-ⅠPG-Ⅷ。BCMV是侵染我国豆类的主要病毒之一,豆类是山西省一类特色杂粮作物,我国对BCMV的研究较少,且山西省尚未见对BCMV的研究报道。我们对山西省不同地区疑似被BCMV侵染的豆类样品进行了采集、鉴定和分析,并进行了BCMV侵染性克隆的构建,所取得的主要研究结果如下:1.通过对山西省不同地区采集到的54个疑似被BCMV侵染的豆类作物样品利用BCMV通用引物,通过提取总RNA后进行RT-PCR检测,检测结果表明,我们所采集的山西省部分地区豆类样品BCMV的侵染率高达77.78%,对3个分离纯化后的不同BCMV株系进行全基因组测序,并基于全基因组序列进行核苷酸及氨基酸的分析,随后对3个株系和70个来自NCBI中相似序列构建系统进化树,结果表明:C54和PG1聚在同一支上,亲缘关系较近;C122和US1、US10聚在一支上,亲缘关系较近;DFH和Group1内的BCMV株系没有聚类,但是与其它Group聚类相比,其与Group1内的BCMV株系亲缘关系较近。C54、C122、DFH株系和我国从大豆上检测到的BCMV株系(Group 3)没有聚为一支,表明亲缘关系较远,但是C54、C122、DFH株系与Group1中来自美洲的BCMV株系亲缘关系较近,可能有共同的病毒起源。2.将分离纯化的3个BCMV株系C54、C122、DFH通过摩擦接种在11个含有不同抗性基因组合的菜豆品种上,根据不同株系接种在菜豆品种上的生物表型结合TAS-ELISA的方法确定了3个不同的BCMV致病型,结果表明株系C54属于第Ⅰ致病型、株系C122属于第Ⅳ致病型、株系DFH属于第Ⅷ致病型。3.本实验成功获得了BCMV株系C54全长cDNA侵染性克隆,通过将C54的基因组分为4段分别扩增纯化,利用TAR技术将C54纯化片段通过酵母同源重组克隆至三元载体pCY,通过电转农杆菌GV3101后使用菌液浸润的方法介导转化本氏烟,接种3~4周后提取本氏烟叶片总RNA进行RT-PCR检测,检测及测序结果表明:4.农杆菌介导pCY-C54成功侵染本氏烟。但是,将被侵染性克隆侵染的本氏烟系统叶片通过机械摩擦接种菜豆感病品种DW后,未发现其产生病毒侵染的症状且RT-PCR未检测到BCMV的存在,表明该侵染性克隆未能成功侵染菜豆。本实验通过TAR技术利用三元载体pCY成功获得了能够在本氏烟上侵染的BCMV全长cDNA侵染性克隆,但该克隆未能成功侵染菜豆,具体原因有待分析。
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