目的:A型流感病毒是有包膜的单链负股RNA病毒。流感病毒的包膜来源于宿主细胞膜的磷脂双分子层,外部包含两种非常重要的糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。流感病毒包膜下是病毒基质蛋白M1,其内包裹着携带流感病毒的基因组的vRNP复合物。流感病毒入侵宿主细胞后,病毒包膜破开,vRNP释放并被转运至细胞核中。细胞核中的vRNP进行复制、转录,新合成的病毒RNA与病毒蛋白组装成新的vRNP复合物并集中到包膜附近,通过出芽的方式形成子代流感病毒,释放并感染新的细胞。病毒vRNP复合物具有聚合酶和核酸内切酶活性,在流感病毒cRNA、vRNA、mRNA的合成中发挥关键的作用。circRNA是一类呈环形存在的没有5’帽结构和3’端poly（A）尾的一类非编码RNA。因其独特的环形结构,circRNA不易被核酸外切酶识别消化,与线性RNA相比更为稳定。目前已有多项研究表明circRNA在调控细胞免疫、肿瘤生长凋亡、细胞代谢、细胞自噬等方面发挥重要的作用。流感病毒侵入细胞后会破坏宿主细胞的正常生理状态,影响一些宿主因子的表达,这些有差异表达的宿主因子往往可以通过调控天然免疫、病毒RNA的生成、子代病毒释放等方式促进或抑制流感病毒的复制。目前,已有许多证据表明宿主蛋白可以参与流感病毒的复制进程,但对于非编码RNA,尤其是circRNA如何调控流感病毒复制的研究较少。本研究探究了流感病毒感染A549细胞后显著上调的circ-IUC1在流感病毒复制过程中的功能及调控机制,提示了circRNA可能在流感病毒的复制进程中发挥着极其关键的作用。研究方法:本研究通过RNA深度测序技术筛选出了在流感病毒感染A549细胞后表达上调的circRNA,circ-IUC1,并通过实时荧光定量PCR技术对测序结果进行了验证。用SeV、poly（I:C）、IFN-β处理293T细胞并提取细胞RNA进行反转录及实时荧光定量PCR检测是否circ-IUC1可以被IFN-β信号通路所诱导。我们通过PCR及实时荧光定量PCR技术证明了circ-IUC1成环存在,并对其生化特性进行了验证。通过核质分离和FISH技术我们确定了circ-IUC1亚细胞定位。我们构建了circ-IUC1的过表达及敲低细胞系,通过Western Blot检测了染毒后细胞内M1、NP蛋白水平,并通过噬斑实验计算了细胞染毒后培养上清中的病毒滴度,以确定circ-IUC1是否对流感病毒复制存在调节作用。为了探究circ-IUC1调控流感病毒复制的具体机制,我们通过RNA pull down技术富集了circ-IUC1在流感病毒感染过程中结合的蛋白并进行质谱检测,筛选到了在流感病毒感染过程中和circ-IUC1存在相互作用的蛋白NP,并通过RIP、RNA pull down技术对circ-IUC1与NP的结合进行了验证。为了确定circ-IUCl如何通过结合NP调控流感病毒复制,我们通过luciferase assay探究了circ-IUC1对流感病毒聚合酶复合物活性的作用,并用实时荧光定量PCR技术检测了过表达circ-IUC1对流感病毒vRNA、cRNA、mRNA表达水平的影响。我们通过免疫共沉淀实验探究了circ-IUC1是否会干扰流感病毒NP自聚化。最后我们通过免疫共沉淀实验验证了 circ-IUC1对NP与PB1、PB2结合中的作用,进而确定了circ-IUC1调控流感病毒复制的具体机制。结果:1、RNA深度测序结果显示在流感病毒感染A549细胞后,circ-IUC1的表达量显著升高。通过实时荧光定量PCR技术验证,我们发现circ-IUC1在A549细胞感染WSN、PR8、CA04三种流感病毒毒株后均存在显著上调,且circ-IUC1的上调呈现明显的时间依赖关系。除流感病毒外,用SeV刺激293T细胞后circ-IUC1表达水平明显上调,用双链RNA类似物poly（I:C）转染293T细胞也可以检测到circ-IUC1表达量的明显升高。用IFN-β处理293T细胞后,circ-IUC1的表达随着IFN-β剂量的增加而上升。以上结果表明在流感病毒、SeV、poly（I:C）、IFN-β多种刺激源诱导下,circ-IUC1的表达量均存在显著上升。2、为了确定circ-IUC1是否具有circRNA普遍存在的生化特性,我们检测了circ-IUC1抗RNaseR消化的能力及稳定性。结果显示,circ-IUC1被RNaseR消化后含量并无明显变化,用放线菌素D处理A549细胞72小时后circ-IUC1含量无明显减少,证明了circ-IUC1可以有效抵抗RNaseR的消化,并具有很强的稳定性。我们通过核质分离技术及FISH实验检测了circ-IUC1在细胞中的定位情况,结果显示细胞中大多数circ-IUC1存在于细胞质中。3、为了探究circ-IUC1能否调控流感病毒复制,我们首先通过慢病毒表达系统构建了A549过表达circ-IUC1稳定细胞株。过表达细胞株中circ-IUC1上调了 12倍。在A549过表达稳定细胞株和对照细胞株中染毒,检测细胞中病毒蛋白水平及上清病毒滴度,结果显示过表达circ-IUC1可以明显抑制流感病毒蛋白M1、NP的表达水平及上清中的病毒滴度。同时,我们也运用慢病毒表达系统构建A549的circ-IUC1稳定敲低细胞株。敲低细胞株中circ-IUC1的表达量显著降低。在A549敲低细胞株和对照细胞株中染毒,检测细胞病毒蛋白的水平及上清病毒滴度,结果显示敲低circ-IUC1可以明显促进流感病毒蛋白M1、NP的表达水平及上清中的病毒滴度。以上结果均表明circ-IUC1可以显著抑制流感病毒的复制。4、为了探究circ-IUC1调控流感病毒复制的具体机制,我们通过RNA pull down技术富集到circ-IUC1在染毒情况下结合的蛋白并进行质谱检测,结果显示在染毒的情况下circ-IUC1可能与流感病毒NP蛋白存在相互作用。我们通过RIP及RNA pull down技术验证并确认了染毒情况下circ-IUC1与NP的结合。为了确定circ-IUC1与NP的结合是否有其他流感病毒蛋白的参与,我们在293T细胞中转染FLAG-NP并检测circ-IUCl与NP的相互作用,结果显示在无其他流感病毒蛋白存在的情况下,circ-IUC1与NP仍可以发生明显的结合。以上结果证明了在细胞感染流感病毒的情况下,circ-IUC1可以与NP发生相互作用,且二者的相互作用无需其他流感病毒蛋白介导。5、鉴于NP蛋白在vRNP复合物中的关键作用,我们在293T细胞及293T-IAV-luc细胞株中检测circ-IUC1对流感病毒聚合酶复合物活性的影响。结果显示过表达circ-IUC1对流感病毒vRNP复合物的相对luciferase活性存在明显抑制作用。除此之外,我们在293T细胞中转染circ-IUC1后感染流感病毒,发现过表达circ-IUC1后,流感病毒M1、NP的cRNA、vRNA、mRNA水平均有显著降低,表明circ-IUC1可以通过抑制vRNP复合物活性干扰流感病毒的转录和复制。6、为了探究circ-IUC1调控vRNP复合物活性的机制,我们首先检测了circ-IUC1对NP自聚化的影响。在293T细胞中通过免疫共沉淀技术检测NP的自聚化水平发现过表达circ-IUC1后,细胞中FLAG-NP与myc-NP的结合程度并无改变。我们进一步确认了circ-IUC1对NP与vRNP复合物头部蛋白PB1、PB2相互作用的影响,结果表明293T细胞过表达circ-IUC1后,NP与PB1及PB2蛋白之间的结合作用明显减弱,证明了circ-IUC 1通过干扰NP与PB1、PB2蛋白的相互作用抑制vRNP复合物的活性。结论:1、circ-IUC1在A549感染三种流感病毒毒株WSN、CA04、PR8后表达量显著升高,且在IFN-β信号通路激活的情况下会被诱导表达。2、circ-IUC1具有能够抵抗RNaseR消化且稳定性很强的生化特性。在流感病毒感染前后,circ-IUC1均主要定位于细胞质中。3、circ-IUC1可以抑制流感病毒复制。4、在流感病毒感染过程中,circ-IUC1与流感病毒NP蛋白存在明显的相互作用。从机制角度,circ-IUC1并不会影响流感病毒NP蛋白的自聚化,而是通过结合NP蛋白干扰NP与PB1、PB2蛋白的相互作用,进而抑制流感病毒vRNP复合物的活性及病毒cRNA、vRNA、mRNA的生成,阻碍流感病毒复制。