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研究目的:疟疾是通过雌性按蚊传播的,以疟原虫属的单细胞寄生虫为病原体的疾病。恶性疟原虫有着极其复杂的生活史,每个生长周期都有着严密且精准的基因表达调控机制。流行病学研究发现在疟疾低传染地区,恶性疟原虫更倾向于配子体生殖,配子体生成决定因子PfAP2-G和配子体相关基因表达上调,同时伴随着PfHDAC1表达下调和PfHDA1表达上调,这提示了PfHDAC1和PfHDA1可能参与了恶性疟原虫配子体的生成过程,但组蛋白去乙酰化酶PfHDAC1和PfHDA1的功能和作用机制尚不明确。本研究基于CRISPR-Cas9系统对PfHDAC1和PfHDA1进行条件性敲除,结合RNA-seq和ChIP-seq等技术来探究PfHDAC1和PfHDA1在恶性疟原虫无性期感染入侵阶段和配子体生成过程中的功能及调控机制,从而帮助我们深入了解疟原虫组蛋白去乙酰化酶家族在疟原虫生长发育过程中的重要作用,为今后抗疟药的靶点筛选提供理论基础。研究方法:1、生物信息学分析。在Plasmo DB网站上获取PfHDAC1（PF3D7＿0925700）和PfHDA1（PF3D7＿1472200）的基因序列和glm S-Ribozyme条件性敲除标签序列。2、基因编辑。应用CRISPR-Cas9系统获得PfHDAC1和PfHDA1条件性敲除虫株和融合标签虫株。3、Western blot。通过Western blot检测PfHDAC1和PfHDA1基因修饰虫株是否能正常表达目的蛋白,分别使用TY1、Flag和Actin抗体进行检测。4、RT-qPCR检测PfHDAC1和PfHDA1在各时期的转录水平。5、IFA确定PfHDAC1和PfHDA1在蛋白水平上的表达特点。6、流式细胞术分析PfHDAC1条件性敲除虫株生长速度。在疟原虫入侵红细胞后的第一个生长周期内连续取样,分别在12 h、24 h、36 h和48 h取样后立即进行红细胞固定,统一进行SYBR GREEN染色后上机,分析结果。7、体外配子体诱导实验。分别对PfHDAC1和PfHDA1条件性敲除虫株及相应对照组体外诱导配子体并计数原虫率,控制起始原虫率和红细胞压积。8、RT-qPCR检测感染入侵基因和早期配子体生成基因的相对表达量。9、RNAseq。收取各时期PfHDAC1和PfHDA1条件性敲除虫株及相应对照组的RNA样品,进行转录组二代测序。10、ChIP-seq。收取裂殖体晚期PfHDAC1和PfHDA1融合标签虫株的ChIP固定样品,使用ChIP级别的Flag标签抗体孵育,纯化得到与目的蛋白相互作用的DNA,进行全基因组测序,生物信息学分析并观察PfHDAC1和PfHDA1在疟原虫染色体上的分布和富集程度。11、ChIP-qPCR。收取裂殖体晚期的PfHDAC1和PfHDA1条件性敲除虫株及相应对照组的ChIP固定样品,使用H3K9-Ace抗体进行ChIP实验,通过ChIP-qPCR检测PfHDAC1和PfHDA1各自调控基因的启动子区域H3K9-Ace水平的变化。研究结果:1、成功获得PfHDAC1和PfHDA1基因修饰虫株。经WR和BSD药物筛选后有限稀释法获得单克隆虫株,PCR和测序结果均证明对PfHDAC1和PfHDA1的基因修饰成功。Western blot验证PfHDAC1和PfHDA1基因修饰虫株可正常表达融合标签后的目的蛋白。2、PfHDAC1和PfHDA1的表达水平在裂殖体晚期最高。3、PfHDAC1和PfHDA1定位在疟原虫细胞核内。在环状体时期定位呈点状;滋养体晚期和裂殖体晚期定位呈核内弥散。4、PfHDAC1调控疟原虫无性期感染入侵基因并影响无性期的生长速度。PfHDAC1条件性敲除之后,疟原虫生长速度变快,RNA-seq显示大部分疟原虫感染入侵基因表达明显上调,ChIP-seq结果显示PfHDAC1在这些感染入侵基因的启动子区域明显富集,ChIP-qPCR结果证明PfHDAC1条件性敲除后大部分感染入侵基因的启动子区域H3K9-Ace水平上升。5、PfHDAC1条件性敲除后促进配子体生成同时早期配子体生成基因表达上调。PfHDAC1条件性敲除后配子体生成率和配子体形成率均上升。RNA-seq显示早期配子体生成基因表达上调,ChIP-seq结果显示PfHDAC1在早期配子体基因的启动子区域高度富集,ChIP-qPCR结果也验证了PfHDAC1条件性敲除后早期配子体生成基因的启动子区域H3K9-Ace水平上升。6、PfHDA1通过调控PfHDA2的表达来影响配子体生成,体外诱导配子体实验发现PfHDA1条件性敲除后配子体生成率和配子体形成率均下降,早期配子体生成基因表达下调,PfHDA2表达上调,ChIP-seq结果显示PfHDA1在PfHDA2启动子区域有明显富集,ChIP-qPCR结果也验证了PfHDA1条件性敲除后PfHDA2启动子区域H3K9-Ace水平上升。研究结论:1、PfHDAC1和PfHDA1在恶性疟原虫无性期阶段裂殖体晚期表达量最高。2、PfHDAC1和PfHDA1均定位在恶性疟原虫细胞核内。3、PfHDAC1条件性敲除后影响恶性疟原虫无性期的生长速度并且促进配子体的生成;PfHDA1条件性敲除后配子体生成减少。4、PfHDAC1通过调控感染入侵基因和早期配子体生成基因的表达介导不同时期恶性疟原虫的生长发育;PfHDA1通过调控PfHDA2的表达介导配子体的生成。