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目的:气道黏液分泌增多和肺泡液体蓄积是众多肺部疾病的共同特征,不仅影响呼吸道病原体的清除,还增加氧气从空气中扩散到气道上皮的距离,导致气道上皮缺氧。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞失去上皮特性,并获得间质细胞特性的生物学过程。由EMT介导的气道上皮重塑是慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺纤维化等呼吸系统疾病难以治愈的重要原因之一。但是气道上皮缺氧通过何种机制介导EMT目前并不清楚。本课题中,我们旨在建立一种能够模拟病理条件下呼吸道上皮缺氧的细胞模型,并在此模型上明确缺氧是否能导致EMT的发生。同时探索缺氧条件下气道上皮细胞发生的EMT是由何种细胞介导,应用单细胞测序分析探究细胞发生EMT的可能机制,并进一步应用分子生物学实验明确相关信号通路是否参与缺氧所致的EMT过程。此研究成果将为临床预防和治疗缺氧所致EMT相关疾病提供新的见解和思路。研究方法:一、明确缺氧是否能诱导EMT的发生1、用低温酶消化法分离得到小鼠气管上皮细胞（mouse tracheal epithelial cells,MTECs）,在Transwell小室中采用气液交界面模式（air-liquid interface,ALI）培养至细胞完全分化,采用HE染色、透射电镜、共聚焦显微镜对MTECs的形态学及生物物理学特征进行观察。2、采用Western blot方法对MTECs中基底细胞和纤毛细胞的标志物进行检测。3、为模拟液体在气道滞留和蓄积时的病理情况,向MTECs顶膜侧加入150μl培养液,目的在于使MTECs的培养模式从ALI转换到液液界面（liquid-liquid interface,LLI）培养模式。在LLI模式培养METCs之后6、12、24小时,以及2、4、8天,应用Western blot方法对MTECs中的缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）1α和2α进行检测,以明确LLI培养模式是否造成了MTECs缺氧。4、在培养H441细胞的6孔板中加入8 ml培养液（正常对照组2 ml）6、12、24小时后,应用Western blot的方法检测细胞内HIF1α的表达水平。同时用300μM的Co Cl2作为阳性对照处理H441细胞,检测细胞内HIF1α的表达水平。5、在MTECs缺氧后,对MTECs进行HE染色,观察其形态学改变。6、应用Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）的方法分别检测上皮细胞标志物（上皮-钙黏蛋白）、间质细胞标志物（波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白）、基底细胞标志物（角蛋白5）在缺氧后表达水平的变化。二、探讨缺氧条件下发生EMT的细胞类型及可能参与的信号通路1、用角蛋白5和波形蛋白的抗体对MTECs进行标记,并采用流式细胞仪检测基底细胞和间质细胞在缺氧后数量的变化,分析两种标志物的共表达情况。2、应用荧光显微镜观察间质和基底细胞数量在缺氧后的变化,以及两种细胞标志物的共表达。3、用角蛋白5的抗体对MTECs中的基底细胞进行标记,在流式细胞仪上分选MTECs中的基底细胞。4、采用qRT-PCR检测基底细胞和其他细胞（杯状细胞、棒状细胞、纤毛细胞、肺部离子细胞、肺神经内分泌细胞、簇状细胞）在不同培养模式下EMT标志物表达水平的改变,以明确缺氧条件下介导EMT的细胞类型。5、应用Seurat分析单细胞测序数据集中基底细胞与其他细胞的差异基因,并对差异基因进行KEGG富集分析,探索基底细胞中可能参与到EMT过程的信号通路。三、探讨核糖体参与缺氧所致EMT的可能机制1、在转录水平检测基底细胞中核糖体及核糖体蛋白RNA的表达水平,明确核糖体生物合成在缺氧后的变化。2、应用核糖体生物合成的特异性抑制剂（CX5461）后,通过Western blot和qRT-PCR分别检测缺氧条件下上皮-钙黏蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和m RNA表达水平。3、通过HE染色,观察CX5461对MTECs形态学的影响。4、应用波形蛋白的抗体对MTECs进行标记,在免疫荧光显微镜下观察加入CX5461后缺氧对间质细胞数量的影响。5、应用Western blot检测核糖体下游信号通路m TOR和AKT的磷酸化水平。结果:一、缺氧可以诱导EMT的发生1、应用ALI模式培养的MTECs和气管组织形态类似,都是假复层结构,透射电镜结果显示MTECs的顶膜侧具有纤毛样结构,并存在细胞间紧密连接。通过共聚焦显微镜对MTECs表面液体进行观察发现其高度大约为8μm,与在体条件下的气道表面液体高度基本相符。2、采用ALI模式培养的MTECs中表达基底细胞和纤毛细胞标志物,提示ALI模式培养的MTECs中细胞类型与在体情况基本一致。3、HIF1α在LLI模式培养6小时后表达水平即显著上升,HIF2α在LLI模式培养2天后表达水平显著上升,提示LLI培养模式造成了MTECs缺氧。4、H441细胞中的HIF1α表达水平在过量培养液培养24小时后表达显著增加。另外,300μM Co Cl2处理细胞2小时后细胞中的HIF1α表达水平显著上升。5、MTECs缺氧后,假复层结构消失,并且细胞形态由立方形转变成了梭形。6、在MTECs缺氧4天后,上皮-钙黏蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和角蛋白5的蛋白及m RNA表达发生显著改变,提示缺氧诱导了EMT的发生。二、缺氧条件下发生的EMT主要由基底细胞介导1、基底细胞和间质细胞数量都在缺氧后显著增加,并且缺氧条件下增加的间质细胞几乎均阳性表达基底细胞标志物（角蛋白5）,提示基底细胞可能参与了缺氧条件下的EMT。2、通过免疫荧光显微镜,我们观察到缺氧后MTECs中阳性表达基底和间质细胞标志物的细胞数量均显著增加,同时两种细胞的标志物存在共表达。3、在缺氧条件下EMT标志物表达水平的改变主要由基底细胞介导。4、富集分析显示基底细胞与其他细胞的差异基因主要富集在核糖体信号通路。三、核糖体参与缺氧所致EMT的相关机制1、核糖体及核糖体蛋白RNA在缺氧条件下表达水平显著增加。2、应用核糖体生物合成的抑制剂CX5461后,EMT标志物在缺氧条件下的表达改变不再显著。3、HE染色结果显示,CX5461抑制了缺氧所致的MTECs形态学改变。4、CX5461显著抑制了缺氧条件下间质细胞数量的增加。5、CX5461降低了缺氧条件下m TOR和AKT的磷酸化水平。结论:气道上皮缺氧导致的EMT主要由基底细胞介导,并且核糖体-m TORC2-AKT信号通路在此过程中发挥重要作用。