目的:脑型疟疾（cerebral malaria,CM）是恶性疟原虫感染后最严重的并发症,以中枢神经系统功能障碍为特征,每年造成近40万非洲儿童死亡。虽然确切的分子机制尚不清楚,但能肯定的是CM发生是由多种因素共同作用的,包括血管机械阻塞、细胞因子失调、趋化因子产生和炎症等。目前的研究认为,CM发病机制主要与免疫系统的过度激活和促炎细胞因子的分泌相关,如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-12等。这些细胞因子促进脑血管内皮细胞黏附分子的表达,导致疟原虫感染的红细胞在脑微血管内隔离,同时也可诱导趋化因子的产生,增强CD8+T细胞与血管内皮之间的黏附。由于感染的红细胞和免疫细胞在脑血管内积聚,引起血管阻塞、脑血管内压力升高以及血脑屏障的通透性增加,易发生脑水肿,从而诱发CM。因此,调控T细胞介导的炎症反应,对于抑制免疫病理损伤和CM的发生至关重要。T细胞免疫调节蛋白（T cell immunomodulatory protein,TIP）是由Fiscella等研究者发现的一种可以抑制T细胞免疫应答的蛋白,其在急性移植物抗宿主疾病小鼠模型体内有保护作用,能够明显抑制移植物引起的免疫排斥反应,提示TIP具有抑制机体免疫应答的功能。生物信息学分析发现,在多种疟原虫中均存在与TIP结构相似的蛋白。然而,疟原虫TIP样蛋白与TIP在功能上是否具有较高的相似性,其在疟原虫不同发育阶段的表达定位情况,以及能否抑制宿主对疟原虫的免疫攻击等问题尚不明确。因此,本课题拟在前期工作基础上,对伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白（P.berghei T cell immunomodulatory protein,PbTIP）的表达和定位进行研究,并通过P.berghei ANKA感染C57BL/6小鼠,建立实验性脑型疟疾（experimental cerebral malaria,ECM）模型,进一步探讨PbTIP在CM发生发展中的作用,力求揭示可能存在的免疫调节机制,为疟疾的有效防治提供新的理论基础和科学依据。研究方法:1、PbTIP的生物信息学分析。应用BLAST进行多重序列比对,并用MAGA 5分析进化树;应用SMART预测蛋白结构域,并用Photoshop和DOG 2.0软件绘制模式图;应用在线软件（http://imed.med.ucm.es/）分析抗原决定簇。2、rPbTIP的表达和纯化。我们选取除跨膜区以外的区域（30-659aa）表达重组PbTIP（rPbTIP）。利用引物PbTIP-F和PbTIP-R扩增目的片段,将其克隆到p ET28a载体上,并将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）细胞,在1.0 m M IPTG、15℃条件下诱导16 h。重组蛋白经Ni-NTA柱纯化后,BCA法测定其浓度,并通过10%的SDS-PAGE凝胶电泳确定蛋白的纯度和分子量。3、rPbTIP免疫血清的制备。雌性6-8周龄的BALB/c小鼠,经皮下多点注射rPbTIP（50μg/只）与完全弗氏佐剂的乳化产物,每隔两周加强免疫一次rPbTIP（25μg/只）,共强化两次,对照组采用相同的免疫程序皮下注射PBS。每次免疫前和末次免疫后10天采集小鼠血清,ELISA检测相应血清的抗体效价。4、PbTIP表达和定位的检测:（1）使用Nycodenz密度梯度分离和纯化P.berghei的滋养体、裂殖体、配子体和动合子,提取总RNA并反转录为c DNA,经特异性引物扩增后,q PCR检测PbTIP的m RNA表达情况。（2）将纯化的疟原虫重悬于含有2%SDS和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中,提取总蛋白,应用rPbTIP免疫血清进行Western blot分析PbTIP的表达阶段,并检测感染小鼠血清和动合子培养上清中是否存在PbTIP。（3）应用rPbTIP免疫血清进行IFA,分析PbTIP在疟原虫不同阶段的细胞定位,并通过共聚焦显微镜获取图像。5、PbTIP传播阻断活性的评估。将rPbTIP免疫血清或对照血清用动合子培养基以1:5、1:10和1:50的比例稀释,并与10μl含有等量成熟配子体的小鼠血液混合,分别于25℃、15 min和19℃、24 h培养后,在显微镜下计数出丝中心和动合子。6、体外分析rPbTIP的功能活性。雌性6-8周龄的C57BL/6小鼠,经腹腔注射1×10~6个P.berghei ANKA感染的红细胞,第3天分离脾细胞进行体外培养,分别给予不同浓度的rPbTIP（5、50、500 ng/ml）,以加热失活的rPbTIP（50 ng/ml）作为对照,48 h后收集培养上清,ELISA检测其中IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平变化。7、体内分析PbTIP抑制对CM发生的影响。雌性6-8周龄的C57BL/6小鼠,经腹腔注射1×10~6个P.berghei ANKA感染的红细胞,建立ECM模型。抗rPbTIP血清处理感染组（Pb A+anti-TIP）小鼠分别在感染前（0天）和感染后（1、2天）,尾静脉注射特异性抗体（100μl/只）,感染对照组（Pb A）小鼠在相同时间给予等量的免疫对照血清。（1）每日观察小鼠的生存情况、CM发生时间和症状,并在感染第3天开始制备血涂片,吉姆萨染色后显微镜下计数疟原虫血症。（2）在感染后第8天,小鼠出现神经症状时,随机取出每组小鼠,伊文思蓝（EB）染液法检测血脑屏障的完整性。（3）在感染后第8天,小鼠出现神经症状时,随机取出每组小鼠,脑组织经固定、包埋和切片后,用于苏木素伊红（HE）染色,观察脑微血管阻塞和白细胞浸润情况。（4）在感染后第0、3、5天,分离小鼠脾细胞,采用流式细胞术检测其中Th1细胞、调节性T细胞（Tregs）、树突状细胞（DCs）及其亚群的比例。（5）在感染后第0、3、5天,分离小鼠脾细胞,q PCR检测IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的m RNA水平。（6）在感染后第0、3、5天,分离小鼠脾细胞,培养48 h后收集上清,ELISA检测IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的表达水平。结果:1、疟原虫数据库Plasmo DB将PbTIP描述为“保守的疟原虫蛋白,暂不知其功能”。该基因（PBANKA＿1243600）位于第12号染色体上,共编码703个氨基酸,分子量为80.4 k Da。蛋白结构域预测显示,PbTIP在N、C两端均存在一小段跨膜区,此外还含有一个VCBS黏附结构域;系统发育分析表明,PbTIP在疟原虫种属中是比较保守的,并且与人类TIP结构相似。2、我们选取了630个氨基酸的片段合成目的基因,并成功构建原核表达载体p ET28a-PbTIP,经诱导表达和亲和层析纯化后,获得了高纯度的rPbTIP。SDS-PAGE电泳显示,目的条带单一且清晰,与预测的分子量相符（约73 k Da）,测定蛋白浓度为0.96 mg/ml。3、小鼠经rPbTIP免疫后产生的血清抗体滴度显著高于对照组,表明rPbTIP具有较强的免疫原性。4、PbTIP的表达和定位情况:（1）q PCR结果显示,PbTIP在滋养体、裂殖体、配子体以及动合子阶段均有m RNA表达,且水平无明显区别。（2）对纯化疟原虫的蛋白提取物进行Western blot分析显示,rPbTIP抗体在滋养体、裂殖体、配子体和动合子处特异地识别出约80 k Da的条带,符合预测的蛋白分子量;此外,在感染小鼠血清和动合子培养上清中,我们也检测到少量PbTIP的存在,表明PbTIP也许可以分泌到细胞外。（3）IFA结果显示,PbTIP均匀分布于滋养体、裂殖体以及雌雄配子体的胞质中,而在感染红细胞的膜表面和胞质中几乎没有染色,并且PbTIP主要表达在雌雄配子和动合子的膜表面,提示PbTIP存在于疟原虫生长发育的不同阶段。5、PbTIP不具有传播阻断活性。与免疫对照血清相比,抗rPbTIP血清以1:5、1:10和1:50的比例稀释,均不能有效抑制P.berghei雄配子和动合子的形成。6、rPbTIP具有免疫调节活性。在三种浓度的rPbTIP作用下,脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达水平有所降低;在500 ng/ml用量下IL-10水平升高,在50和500 ng/ml用量下TGF-β水平显著升高,而热失活的rPbTIP对上述细胞因子的产生没有任何影响。7、PbTIP在CM发生中的作用和机制:（1）Pb A组小鼠在感染后第9天开始死亡,并伴有神经症状,直到第11天全部死亡,而Pb A+anti-TIP组小鼠在感染后第8到9天之间全部死亡;血涂片结果显示,在感染后第7天,Pb A+anti-TIP组小鼠的疟原虫血症水平低于Pb A组。（2）EB染色结果显示,与Pb A组相比,Pb A+anti-TIP组小鼠的血脑屏障被严重破坏,有明显的EB渗出。（3）HE染色结果显示,Pb A+anti-TIP组小鼠脑组织中白细胞浸润的血管数量显著多于Pb A组。（4）流式细胞术分析显示,在感染第3和5天,Pb A+anti-TIP组小鼠Th1细胞的比例均高于Pb A组;在感染第3天,两组之间Tregs的比例无明显差异,第5天Pb A+anti-TIP组Tregs比例低于Pb A组;在感染第3天,Pb A+anti-TIP组小鼠DCs、m DCs和p DCs的比例均高于Pb A组,并且高表达MHCⅡ类分子,但第5天两组间这些细胞无明显变化。（5）q PCR结果显示,感染后第3天,Pb A+anti-TIP组小鼠脾细胞中IFN-γ和TNF-α转录水平均高于Pb A组,第5天Pb A+anti-TIP组IFN-γ水平高于Pb A组;感染后第3天,两组间IL-10和TGF-β转录水平无明显差异,第5天Pb A+anti-TIP组IL-10和TGF-β水平均低于Pb A组。（6）ELISA结果显示,感染后第3天,Pb A+anti-TIP组小鼠脾细胞培养上清中TNF-α水平显著高于Pb A组,第5天Pb A+anti-TIP组IFN-γ水平高于Pb A组;感染后第3天,两组间IL-10和TGF-β水平无明显变化,第5天Pb A+anti-TIP组IL-10水平低于Pb A组。结论:1、PbTIP存在于疟原虫生长发育的不同阶段,并且能够以可溶性形式分泌到红细胞外。2、rPbTIP具有免疫调节作用,可使促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达下调,而使抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的表达上调。3、PbTIP参与介导CM的发生,抑制PbTIP可使小鼠的生存期缩短,并加重小鼠的CM症状。4、PbTIP可调控Th1应答,抑制PbTIP使小鼠Th1细胞的比例增加,促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达上调。5、PbTIP可调控Tregs应答,抑制PbTIP使小鼠Tregs的比例减少,抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的表达下调。6、PbTIP通过影响DCs的分化和成熟,参与调控Th1和Tregs免疫应答,从而改变CM的进程。