钛基材料是最常用的生物医用金属材料,但钛材料具有生物惰性,植入骨组织后常导致钛-骨界面成骨能力弱,组织纤维化,尤其是疏松的骨组织,钛植入物易发生无菌性松动等。如何将钛材料惰性表面改性成生物活性表面,促钛植入物骨整合是生物材料研究的热点。贻贝仿生多肽改性钛材料表面是一种简便、高效的方法,通过一步浸泡法即可将携带生物活性大分子的仿生多肽接枝到钛材料表面,形成生物活性表面,发挥生物活性分子的促骨整合作用。但是,这种依赖生物活性分子的改性方法,易受环境的影响,且易失活、降解等,而且骨髓中的间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的数量是有限的,而在钛材料植入骨组织后募集并进入到钛-骨界面的干细胞数量更少。因此,本研究拟设计一种基于生物正交反应的促进钛植入物骨整合策略,通过不受环境影响的,且不干扰细胞正常生理功能的,更加稳定的生物正交反应化学基团来替代生物活性分子,来实现间充质干细胞的捕获并使其结合于材料表面,发挥干细胞的成骨分化和免疫调节能力,促进骨整合。第一部分 多糖修饰骨髓间充质干细胞的表征及生物学功能鉴定目的:利用细胞糖代谢工程将Ac4ManNAz中的叠氮基团修饰到大鼠BMSCs细胞表面,并评估修饰后对大鼠BMSCs的细胞特性是否产生影响。方法:采用全骨髓法提取大鼠BMSCs并行细胞鉴定,配制不同浓度的多糖溶液。（1）使用不同浓度多糖溶液（0μmol/L,5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,500μmol/L）处理细胞,采用CCK-8测定不同浓度下BMSCs在第1,3,5,7天的细胞活力。（2）对干细胞干性影响的评估:不同浓度多糖处理BMSCs后,流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45的表达。（3）对干细胞免疫原性影响的评估:不同浓度多糖处理后,流式细胞术检测细胞表面CD40,CD80,CD86和MHCⅡ的表达;取小鼠脾脏T淋巴细胞,不同浓度多糖处理后的BMSCs与淋巴细胞共混合,检测淋巴细胞的增殖情况。（4）对干细胞三系分化能力影响的评估:不同浓度多糖处理的BMSCs,分别行成骨、成软骨、成脂诱导分化,诱导后行碱性磷酸酶（ALP）染色及活力测定,茜素红染色及定量,PCR检测Alp和骨桥蛋白（Opn）两个成骨相关基因的表达;行甲苯胺蓝染色,PCR检测Col2a1和Sox-9两个成软骨相关基因的表达;行油红O染色,PCR检测Ppar-γ和Adiponectin两个成脂相关基因的表达。（5）不同浓度多糖处理后,使用荧光探针AZDye 488 DBCO检测BMSCs表面叠氮基团是否成功引入及相应的荧光强度。结果:成功提取大鼠BMSCs细胞,经细胞形态、生长方式和流式鉴定等确定为MSCs。（1）CCK-8结果提示25μmol/L多糖是适宜浓度,此浓度下BMSCs在各时间点均增殖良好,对细胞无毒性作用。（2）不同浓度多糖处理BMSCs后,CD90、CD29、CD34和CD45的表达未受影响,表明细胞表面引入叠氮基团后对干细胞的干性无明显影响。（3）不同浓度多糖处理后,BMSCs表面免疫共刺激分子CD40,CD80,CD86和MHC Ⅱ的表达未受影响,混合淋巴反应也表明各组淋巴细胞增殖处于较低水平,组间无差异,表明叠氮基团引入后,BMSCs仍保留了其低免疫原性的特性。（4）25μmol/L多糖处理与未经多糖处理的BMSCs,经成骨诱导7天后,其ALP染色阳性细胞和ALP活性无明显差异,成骨诱导14天后,茜素红染色及定量两组间无差异,PCR检测成骨相关基因Alp和Opn表达无明显差异;成软骨诱导16天后,两组间甲苯胺蓝染色及成软骨相关基因Col2a1和Sox-9的表达无差异;成脂诱导16天后,两组间油红O染色及成脂相关基因Ppar-γ和Adiponectin的表达无差异。以上结果表明叠氮基团的引入对BMSCs三系分化能力无明显影响。（5）AZDye488 DBCO荧光探针成功检测到多糖处理后大鼠BMSCs表面的叠氮基团,引入叠氮基团的BMSCs表面呈现绿色荧光,且随着多糖浓度的升高,细胞表面绿色荧光的强度也进一步增加。结论:细胞糖代谢工程是一种有效的将叠氮基团修饰到BMSCs表面的方法。25μmol/L浓度的多糖在保证引入足够的叠氮基团的同时,对大鼠BMSCs活力和增殖无影响,是糖代谢工程修饰BMSCs的一个适宜浓度。BMSCs表面引入叠氮基团后,其干性、低免疫原性和三系分化能力均未受影响,仍保留了作为组织工程种子细胞的良好特性。第二部分 贻贝仿生多肽修饰钛植入物表面的表征鉴定目的:设计并合成一种含DBCO基团的贻贝仿生多肽,通过DOPA与钛材料的配位作用,将DBCO基团修饰到钛材料表面。方法:通过Fmoc固相合成法合成含DOPA和DBCO基团的仿生多肽。（1）使用X线光电子能谱仪（XPS）和EDS测定多肽修饰后钛表面化学组成。（2）原子力显微镜观察多肽修饰后钛材料表面形态。（3）水接触角测定多肽修饰后钛材料的亲疏水性。（4）活死染色及CCK-8检测多肽修饰后钛材料的生物相容性。（5）并使用AZDye 488 N3荧光探针检测钛材料表面叠氮基团是否成功接枝。结果:（1）XPS和EDS结果显示多肽接枝后钛材料表面N元素含量明显上升,N/Ti原子比从0.75提高至2.46,表明多肽成功接枝到钛材料表面。（2）AFM观察到多肽接枝钛材料后,材料表面粗糙程度明显增加。（3）水接触角测定表明多肽接枝后钛材料亲水性明显增加。（4）CCK-8结果表明多肽接枝后的钛材料生物相容性良好,第3天细胞活死染色未见明显死亡细胞,第1,3,5,7天细胞增殖良好。（5）AZDye 488 N3荧光探针成功检测到多肽接枝后钛材料表面的DBCO基团,引入DBCO基团的钛材料表面呈现明显的绿色荧光,而未接枝多肽的钛材料表面不显绿色荧光。结论:贻贝仿生多肽可以通过一步浸泡法,通过DOPA基团与TiO2发生配位作用而接枝到钛材料表面,并成功引入DBCO基团,为后续叠氮基团修饰的BMSCs在材料表面的结合提供结合位点。接枝多肽后,增加了钛表面的粗糙程度,同时使钛材料亲水性明显增加。第三部分 基于生物正交点击化学反应促进钛植入物骨整合目的:评估N3修饰的BMSCs与DOPA-DBCO修饰的钛材料之间的生物正交点击化学反应及其促进钛植入物骨整合的作用。方法:体外评估:（1）体外评估N3修饰的BMSCs与DOPA-DBCO修饰的钛材料的结合作用,包括:将N3修饰/未修饰的BMSCs结合于DBCO修饰/未修饰的钛材料,荧光探针AZDye 488 N3检测钛材料表面修饰的DBCO基团是否被BMSCs表面N3结合;将N3修饰/未修饰的BMSCs悬浮于孔板中,孔板底部放置DBCO修饰/未修饰的钛材料,将孔板放置于摇床上摇曳震荡3分钟和30分钟,计数钛材料表面BMSCs数量;（2）将N3修饰/未修饰的BMSCs接种于DBCO修饰/未修饰的钛材料表面,行第1,3,5,7天CCK-8和第3天活死染色评估BMSCs在材料表面的增殖活性。（3）将N3修饰/未修饰的BMSCs接种于DBCO修饰/未修饰的钛材料表面,并加入成骨诱导培养基行成骨诱导,于第7天行ALP染色和活力测定,第14和21天行茜素红染色及定量,第7天行PCR检测成骨相关基因Alp、Opn的表达。体内评估:建立大鼠股骨髁钛螺钉植入模型,钉道内注入N3修饰/未修饰的BMSCs,并植入DBCO修饰/未修饰的钛螺钉,4周后取出股骨标本,评估钛螺钉周围骨整合情况,包括:①Micro CT扫描钛螺钉周围骨组织及骨小梁参数;②荧光染色评估钛螺钉周围组织内巨噬细胞亚群的表达情况;③行硬组织切片评估钛螺钉周围新骨长入及钉-骨界面整合情况;④行生物力学测试,检测钛螺钉的抗拔出力。结果:体外评估:（1）DBCO修饰的钛材料在AZDye 488 N3荧光探针染色下呈绿色荧光,而N3修饰的BMSCs与DBCO修饰的钛材料结合后,将钛材料表面的N3结合位点（DBCO基团）预先结合,因而AZDye 488 N3荧光探针无结合位点而不能显色;第3分钟及第30分钟,只有N3修饰的BMSCs可大量结合于DBCO修饰的钛材料表面,表明两者之间通过点击化学反应而使BMSCs稳定地结合于材料表面。（2）N3修饰的BMSCs结合于DBCO修饰的钛材料表面,细胞稳定增殖,活性无明显影响。（3）成骨诱导第7天ALP染色、活力测定及Alp和Opn的基因表达除空白对照组,其余各组间无明显差异,诱导第14天和21天,茜素红染色和定量结果同ALP结果一致。体内评估:成功建立大鼠股骨髁钛螺钉植入模型,①Micro CT结果表明N3修饰的BMSCs与DOPA-DBCO修饰的钛螺钉共同植入,螺钉周围骨整合最佳,骨体积分数BV/TV,骨表面积密度BS/TV,骨表面积骨体积比BS/BV,骨小梁数目Tb.N,骨小梁平均厚度Tb.Th,骨小梁分离度Tb.Sp均明显优于其它各组;②荧光染色结果显示N3修饰的BMSCs与DBCO修饰的钛螺钉共同植入,钛螺钉周围组织内i-NOS阳性染色的M1型巨噬细胞比例明显低于其它组;③硬组织切片结果显示N3修饰的BMSCs与DBCO修饰的钛螺钉共同植入,螺钉周围可以看到有连续的骨基质覆盖,新骨长入明显优于其它组,骨-植入物接触指标显著优于其它各组;④生物力学测试结果显示,N3修饰的BMSCs与DBCO修饰的钛螺钉共同植入,钛螺钉的抗拔出力明显强于其它各组,表明螺钉与周围骨组织结合稳定,骨整合良好。结论:BMSCs表面修饰的N3基团可以与DOPA-DBCO修饰的钛材料表面接枝的DBCO基团发生生物正交点击化学反应。通过化学键结合,修饰的BMSCs可以被钛材料捕获并结合于表面。结合后的BMSCs在钛材料周围促成骨分化,并发挥免疫调节作用,使材料表面有大量新骨长入,螺钉与周围骨组织形成稳定结合,显著促进钛材料周围骨整合。