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第一部分CLEC5A对心肌梗死小鼠的影响目的:本部分研究探讨CLEC5A对小鼠心肌梗死（myocardial infarction,MI）的影响。方法:将 C57BL/6 小鼠随机分为 4 组:Sham、MI、MI+Ad-NC、MI+Ad-sh-CLEC5A,每组 6 只。将每只小鼠麻醉固定后,打开胸腔,结扎冠状动脉左前降支。Sham组只开胸不结扎。MI+Ad-NC、MI+Ad-sh-CLEC5A组小鼠结扎后,心肌坏死部位附近3点注射Ad-NC或Ad-sh-CLEC5A（CLEC5A抑制剂）,对照组和MI组小鼠注射等量PBS。注射7天后,超声心动图检测各组小鼠LVESD、LVEDD、LVEDV、LVESV,并计算EF和FS;麻醉处死各组小鼠,取心肌组织,免疫印迹法检测梗死半影区CLEC5A的表达,免疫组化检测梗死半影区CLEC5A表达分布,伊文思蓝结合染色检测心肌梗死面积,TUNEL检测梗死半影区心肌细胞凋亡。结果:1.与假手术组相比,MI组的LVESD、LVEDD、LVEDV、LVESV均明显升高,MI组EF和FS明显降低,Ad-sh-CLEC5A处理组,心功能受损较轻（P＜0.001）;2.Ad-sh-CLEC5A成功在模型小鼠中沉默了 CLEC5A的表达（P＜0.001）;3.MI组CLEC5A的表达分布明显增多,而Ad-sh-CLEC5A组小鼠明显降低了 CLEC5A的表达分布;4.MI组心肌梗死区域面积较大（P＜0.001）,而在采用Ad-sh-CLEC5A干预小鼠模型后发现,心肌梗死面积明显减少（P＜0.001）;5.与Sham组相比,MI组TUNEL阳性细胞密度明显增加。与MI组相比,Ad-sh-CLEC5A的干预明显减弱心肌细胞的凋亡。结论:1.CLEC5A与MI后心功能受损有关,可能加重受损程度;2.CLEC5A与MI梗死面积相关;3.CLEC5A可能参与MI心肌损害的病理过程;4.敲低CLEC5A可能减轻MI对心脏的影响。第二部分 CLEC5A对心肌梗死小鼠巨噬细胞活化、炎性小体和细胞焦亡及NF-κB信号通路的影响目的:本部分研究探讨CLEC5A对MI小鼠巨噬细胞活化、炎性小体和细胞焦亡的影响以及其对MI小鼠NF-κB信号通路的影响。方法:将 C57BL/6 小鼠随机分为 4 组:Sham、MI、MI+Ad-NC、MI+Ad-sh-CLEC5A,每组 6 只。将每只小鼠麻醉固定后,打开胸腔,结扎冠状动脉左前降支。Sham组只开胸不结扎。MI+Ad-NC、MI+Ad-sh-CLEC5A组小鼠结扎后,心肌坏死部位附近3点注射Ad-NC或Ad-sh-CLEC5A（CLEC5A抑制剂）,对照组和MI组小鼠注射等量PBS。注射7天后,麻醉处死各组小鼠,取心肌组织,酶联免疫吸附法检测梗死半影区炎性因子IL-6、TNF-α的水平,免疫荧光双染检测梗死半影区MAC-3和iNOS,荧光定量PCR检测梗死半影区iNOS和IL-6的mmRNA水平,免疫印迹法检测梗死半影区心肌组织中 NLRP3、ASC、caspase-1（pro 和 p10）、IL-1β、IL-18、GSDMD、N-GSDMD 的水平,免疫印迹法检测梗死半影区心肌组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65、NF-κB（核）、NF-κB（胞质）的水平。结果:1.MI组与Sham组相比,IL-6和TNF-α的含量明显升高（P＜0.001）;在采用Ad-sh-CLEC5A干预模型小鼠后,IL-6（P＜0.05）和TNF-α（P＜0.01）的含量均被显著抑制;2.iNOS可以与MAC-3共定位,MI组与Sham组相比,单位面积M1型巨噬细胞数量明显增加,在采用Ad-sh-CLEC5A干预模型小鼠后,单位面积M1型巨噬细胞数量显著减少（P＜0.001）;3.MI组与Sham组相比,小鼠梗死半影区iNOS和IL-6的mRNA水平明显增高（P＜0.001）,在采用Ad-sh-CLEC5A干预模型小鼠后,小鼠梗死半影区iNOS和IL-6的mRNA水平均被显著抑制（P＜0.001）;4.在采用 Ad-sh-CLEC5A 干预模型小鼠后,NLRP3（P＜0.001）、ASC（P＜0.001）、裂解的 caspase-1（45 kDa）（P＜0.05）、IL-1β（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）、N-GSDMD（53 kDa）（P＜0.05）蛋白的表达水平均被降低,caspase-1（20 kDa）与 GSDMD（35 kDa）蛋白的无活性前体的蛋白表达水平不变;5.小鼠梗死半影区心肌组织中p-NF-κB p65/NF-κB p65明显增高（P＜0.001）,在采用Ad-sh-CLEC5A干预模型小鼠后,小鼠梗死半影区心肌组织中p-NF-κB p65/NF-K B p65被显著抑制（P＜0.05）;6.MI组小鼠细胞核中NF-κB p65的表达水平较高（P＜0.001）,而在细胞质中表达水平较低（P＜0.001）,这表明NF-κB p65从细胞质向核易位。但是,采用Ad-sh-CLEC5A干预后显著地限制了这种现象（细胞质:P＜0.01,细胞核:P＜0.001）。结论:1.CLEC5A与MI炎症发生有关,且二者关系成正比,敲低后可减轻炎症反应;2.CLEC5A与MI后巨噬细胞活化发生有关,且二者关系成正比,敲低后可减轻巨噬细胞活化;3.CLEC5A与MI后NLRP3炎症小体激活有关,且二者关系成正比,敲低后可减轻NLRP3炎症小体激活;4.CLEC5A与MI后心肌细胞焦亡发生有关,且二者关系成正比,敲低后可减轻MI后心肌细胞焦亡;5.NF-κB信号通路可能参与了 MI后炎症反应,且该信号通路的激活与CLEC5A正相关。第三部分CLEC5A对巨噬细胞极化及小鼠心肌细胞损伤后炎性小体和焦亡的影响目的:采用LPS（Lipopolysaccharides）诱导的小鼠巨噬细胞极化模型探讨CLEC5A对小鼠心肌细胞损伤后炎性小体和焦亡的影响。方法:培养的RAW264.7细胞,随机分为4组:Control、L/I、NC（生理盐水）+L/I（100 ng/ml LPS+20 ng/ml IFN-γ）、sh-CLEC5A+L/I。原代心肌细胞（cardiac myocyte,CMC）与 RAW264.7细胞共培养后,随机分为 5 组:CMC、CMC+RAW264.7、CMC+RAW264.7（L/I）、CMC+RAW264.7（NC+L/I）、CMC+RAW264.7（sh-CLEC5A+L/I）。心肌细胞经分离与培养、传代、复苏、计数等处理,RAW264.7细胞经培养、转染、极化刺激等操作后,用CLEC5A或NC的shRNA转染RAW264.7细胞,通过免疫印迹分析检测敲除效率,荧光定量PCR检测细胞M1型分化后总iNOS和IL-6的mRNA水平,免疫荧光染色检测cTnT的表达,MTT 比色法检测共培养心肌细胞的细胞活力,免疫印迹法检测细胞中 NLRP3、ASC、caspase-1（pro 和 p10）、IL-1β、IL-18、GSDMD、N-GSDMD 的水平。结果:1.RAW264.7细胞经过转染sh-CLEC5A 48 h后,CLEC5A水平显著下降（P＜0.001）,转染效果满意;2.LPS与IFN-γ共处理后RAW264.7细胞中iNOS和IL-6 mRNA水平显著升高,提示巨噬细胞出现M1极化（P＜0.001）。然而,下调RAW264.7细胞内源性CLEC5A的表达明显抵消了该处理细胞方式的M1极化（P＜0.001）;3.免疫荧光染色可见标记明显的原代心肌细胞;4.共培养M1巨噬细胞显著降低了原代心肌细胞的细胞活力（P＜0.05）。然而,在极化的RAW264.7细胞中敲低CLEC5A最终显著补偿了这一作用（P＜0.01）;5.与极化RAW264.7细胞共培养的原代心肌细胞中 NLRP3（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）、N-GSDMD（P＜0.01）和 p10-CASP1（P＜0.001）蛋白水平显著升高,CLEC5A沉默后下降。结论:1.RAW264.7细胞可成功转染sh-CLEC5A RNA;2.LPS可成功诱导的小鼠巨噬细胞发生极化;3.巨噬细胞可显著降低原代心肌细胞的细胞活力,敲低CLEC5A最终可补偿这一作用;4.巨噬细胞极化可导致NLRP3炎性小体的激活和原代心肌细胞的细胞焦亡,而CLEC5A的敲低可显著补偿这些作用。