食管癌（esophageal cancer,EC）是全球最常见的癌症之一,其发病率及病死率均居全球前十位。2020年全球癌症统计数据显示,食管癌的新发病例为59.8万人,死亡病例为54.5万人。在中国,食管癌也是主要的肿瘤相关死亡原因,食管癌的主要病理亚型包括腺癌、鳞状细胞癌和未分化癌。在中国,约90%的食管癌患者为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。食管癌具有局部侵袭明显、疾病进展迅速、复发率高、生存预后差等特点。虽然目前已有手术、化疗、放疗、免疫治疗、内镜切除术（endoscopic resection,ER）、消融、冷冻及氩离子凝固术（hybrid-argon plasma coagulation,APC）等多种治疗方法,但食管癌患者的5年总生存率仍较低。因此,我们急需进一步研究食管癌的发病机制并探索新的治疗方法和策略。溴结构域和超末端结构域（bromodomains and extra-terminal domain,BET）家族蛋白最初被认为是炎症疾病的关键表观遗传调控因子,最近的研究则表明,BET蛋白在肿瘤中的表达失调导致了染色质重塑和基因转录异常并最终介导了肿瘤的发生。BET家族由四种蛋白组成,它们分别是溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4,BRD4）、BRDT（一种睾丸特异性形式蛋白）、BRD3和BRD2。BET蛋白家族中被研究最广泛的成员是BRD4,它可以直接与正向转录延长因子b（positive transcription extension factor b,P-TEFb）结合。BRD4已被证实在基因转录、细胞周期调控、炎症细胞因子产生、细胞增殖和心肌肥厚等生理病理过程中发挥重要作用。此外,BRD4的异常表达在血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的发生发展中发挥着关键的作用,这表明它可能是一个抗肿瘤治疗的潜在靶点。现有的研究已经表明,多种BET抑制剂（如JQ1、I-BET151和MS417）对多种肿瘤有显著的疗效,如急性髓细胞性白血病（acute myelocytic leukemia,AML）、弥漫大B细胞淋巴瘤、混合谱系白血病（mixed lineage leukemia,MLL）、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、晚期肾细胞癌和黑色素瘤。此外,在其它肿瘤中,已有多项研究报道BET抑制剂可下调原癌基因c-Myc及其相关转录活性。然而,BRD4基因表达的改变对食管癌细胞生物学行为的影响及其在食管癌发展中的相关分子机制目前尚不清楚,BET抑制剂JQ1对食管癌的生物学作用及其相关机制也少有报道,仅有的两项关于JQ1对食管癌细胞生物学作用的研究也缺乏如何选择和应用合理的JQ1浓度进行干预和抑制食管癌细胞的相关研究。为进一步探讨和完善上述相关问题,本研究分别从人体组织标本、细胞及动物水平对BRD4与食管癌临床预后的关系及其在食管癌中的生物学作用及机制进行了全面系统的探讨。我们选择了 BRD4表达水平较高的两种人食管癌细胞株,以BET抑制剂JQ1处理这两种细胞株48 h的IC50为依据,选择了合理的JQ1浓度。然后,我们利用合理浓度的JQ1研究其对食管癌细胞的生物学作用及其相关作用靶点及机制。同时,我们通过沉默或过表达人食管癌细胞的BRD4基因进一步深入研究了 BRD4在食管癌中的生物学作用及机制。继而,我们从动物学水平对以上研究结果进行了进一步的验证,从而进一步阐明了 BRD4与食管癌之间的关系,为食管癌的临床诊断、预后预测分析和靶向治疗提供了可能的新的策略和手段。本课题以食管癌为研究对象,分析BRD4在肿瘤组织中的表达及其与临床病理参数及患者预后的关系,探讨BRD4对人食管癌细胞生长及转移等生物学行为的影响及其可能的作用机制。本课题的研究分为三个部分:（1）BRD4在食管癌中的表达及其与临床预后的关系;（2）BRD4在人食管癌细胞中的生物学作用及机制;（3）BRD4对食管癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。第一部分BRD4在食管癌中的表达及其与临床预后的关系研究目的:探讨BRD4在食管癌的表达及其与临床病理特征和患者预后的关系。研究方法:选择人食管癌细胞株（Eca109、TE-1、KYSE-150和Ec9706）和人食管上皮细胞株（Het1A）作为实验细胞。通过荧光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western blot）,采用 ANOVA 加 Dunnett-t 检验,选定两种 BRD4 mRNA 和 BRD4 蛋白表达水平较高的食管癌细胞株进行下一步实验。运用免疫组织化学方法检测BRD4蛋白在107例食管癌肿瘤组织[男78例,年龄（64.7±10.4）岁;女29例,年龄（68.2±7.7）岁]和66例癌旁组织中的表达,使用t检验、u检验或秩和检验比较BRD4蛋白在食管癌癌旁组织与相对应癌组织及Ⅲ期与Ⅰ、Ⅱ期中表达水平的差异。使用卡方检验分析BRD4表达水平与食管癌患者临床病理特征之间的关系。使用Kaplan-Meier生存分析曲线分析BRD4表达与食管癌患者预后的关系。研究结果:经qRT-PCR和Western blot分析发现,在食管癌细胞株Eca109和KYSE-150中BRD4 mRNA和BRD4蛋白表达水平均较高,因此选定这两种细胞进行下一步实验。免疫组化结果显示,BRD4在食管癌肿瘤组织中呈高表达,且与淋巴结转移数量、TNM分期有关（P＜0.05）。在相对应的66例癌组织和癌旁组织中,BRD4在食管癌癌旁组织中的表达明显低于癌组织（P＜0.0001）。同样,BRD4在Ⅲ期肿瘤组织中表达量较高,且BRD4在肿瘤Ⅲ期与Ⅰ、Ⅱ期表达的差异有统计学意义（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析曲线显示,BRD4低表达组（H-score≤130）患者总生存期优于高表达组（H-score＞130）,（P＜0.05）。结论:食管癌肿瘤组织中BRD4的表达高于癌旁组织,且BRD4的表达与患者的淋巴结转移数量、TNM分期有关,BRD4低表达患者预后较好。第二部分BRD4在人食管癌细胞中的生物学作用及机制研究目的:通过体外实验探讨BET抑制剂JQ1及BRD4基因表达变化对食管癌细胞生物学行为的影响及BRD4对食管癌的调控机制。研究方法:用JQ1处理人食管癌细胞株（Eca109和KYSE-150）48 h或构建稳定转染的食管癌细胞株,运用qRT-PCR及Western blot方法检测各组食管癌细胞株BRD4/c-Myc mRNA和蛋白的表达,鉴定其抑制/转染效果。通过CCK8细胞增殖实验和集落形成实验观察各组细胞的增殖和生长。细胞凋亡实验比较各组细胞的凋亡能力。Transwell实验和划痕实验比较各组细胞的侵袭性和迁移性。细胞周期实验比较各组细胞的细胞周期阻滞情况。通过Western blot实验比较各组细胞的c-Myc、Cyclin D1、上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）标志物及Wnt/β-catenin信号通路分子表达的变化。利用功能回复实验评估JQ1对BRD4过表达食管癌细胞株Eca109促进增殖、侵袭及BRD4蛋白表达的抑制情况及c-Myc过表达对BRD4沉默食管癌细胞株KYSE-150抑制增殖、侵袭及c-Myc蛋白表达的逆转情况。采用t检验或秩和检验、重复测量方差分析及ANOVA加Dunnett-t检验比较以上研究结果。研究结果:用JQ1处理或慢病毒转染两种人食管癌细胞株Eca109和KYSE-150后,进行qRT-PCR和Western blot检测表明相应抑制/沉默或过表达的基因均下调或上调,说明抑制有效或慢病毒转染的食管癌细胞株构建成功。CCK8细胞增殖实验和集落形成实验表明,JQ1及沉默BRD4基因可以抑制食管癌细胞的增殖和生长。细胞凋亡检测证实JQ1及沉默BRD4基因可以诱导食管癌细胞发生凋亡。Transwell实验证实JQ1及沉默BRD4基因可以抑制食管癌细胞的侵袭。划痕实验证实JQ1及沉默BRD4基因能够抑制食管癌细胞的迁移能力。细胞周期实验表明沉默BRD4基因后可以诱导食管癌细胞发生细胞周期阻滞。JQ1处理或沉默BRD4基因后食管癌细胞c-Myc、Cyclin D1、Wnt3a和β-catenin蛋白的表达水平下降并可以抑制其EMT。JQ1抑制了 BRD4过表达对食管癌细胞株Eca109增殖、侵袭及BRD4蛋白表达的促进作用。c-Myc过表达逆转了 BRD4沉默对食管癌细胞株KYSE-150增殖、侵袭及c-Myc蛋白表达的抑制作用。以上结果均有统计学差异（P＜0.05）。结论:BET抑制剂JQ1或沉默BRD4基因可以抑制人食管癌细胞的增殖、生长、侵袭和迁移,可诱导食管癌细胞发生细胞凋亡和细胞周期阻滞,并使食管癌细胞的c-Myc和Cyclin D1表达水平下降且抑制了食管癌细胞的EMT及Wnt/β-catenin信号通路的激活。JQ1通过作用于BRD4靶点发挥抗食管癌的作用,BRD4通过调控c-Myc的表达而促进食管癌的发生发展。第三部分BRD4对食管癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响研究目的:通过动物实验分析使用BET抑制剂JQ1或沉默BRD4基因对食管癌细胞增殖能力的影响。研究方法:取含特异性沉默序列的KYSE-150细胞（LV-BRD4-sh1）和阴性对照KYSE-150细胞（LV-NC）,1×108个细胞/150μL分别种植于裸鼠右侧腋窝靠近外侧部位,构建食管癌种植瘤模型,每4天测量肿瘤生长大小,观察移植瘤的生长情况,绘制肿瘤生长曲线,比较两组肿瘤的体积和重量。同样将Eca109细胞（1×108个细胞/150μL）种植于裸鼠右侧腋窝靠近外侧部位,构建食管癌种植瘤模型,待瘤体长至一定大小时,分别予以JQ1和生理盐水处理,观察移植瘤的生长情况,绘制肿瘤生长曲线,比较两组肿瘤的体积和重量。采用t检验或秩和检验及重复测量方差分析进行统计学分析。研究结果:沉默BRD4基因组荷瘤小鼠的肿瘤体积较阴性对照组显著减小、肿瘤重量显著下降。JQ1处理组荷瘤小鼠的肿瘤体积较生理盐水处理组显著减小、肿瘤重量显著下降。以上结果均有统计学差异（P＜0.05）。结论:在小鼠模型中,沉默BRD4基因可抑制食管癌细胞的增殖生长;JQ1可抑制小鼠荷瘤模型中食管癌细胞的增殖生长。