孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一类神经发育障碍性疾病,其核心症状是社交沟通障碍、重复和异常的感觉-运动行为及兴趣或活动范围狭窄,具有很强的遗传性。亚洲ASD的患病率估计为0.36%。ASD可持续一生,严重影响患者生存质量,对家庭和社会造成了巨大的经济和社会负担。世界卫生组织指出因ASD造成的全球负担还在持续增长。遗传因素和环境因素在ASD的发生中都起着至关重要的作用,目前ASD的机制研究多集中于大脑的异常,具体发病机制目前仍不明确。治疗上以行为干预、特殊教育为主,还没有针对核心症状的特效治疗药物,因此探索ASD的病因及发病机制并寻求有效的药物成为人们日益关注的重点。ASD具有高度多基因性,到目前为止发现有近1000个基因与ASD相关。nexmif基因是一个新颖的ASD相关基因,nexmif基因突变或缺失的患者表现出ASD症状。但是到目前为止,nexmif基因的功能研究还很不充分。由于一大部分的ASD儿童共病运动障碍,而脊髓运动神经元突起形态的异常可出现运动缺陷,此外我们前期研究发现nexmif表达于斑马鱼的脊髓,据此我们推测nexmif可以调控脊髓运动神经元形态的发生从而影响ASD的运动行为表型。本课题以斑马鱼为模型,旨在明确nexmif敲降或敲除对斑马鱼脊髓运动神经元形态发育和ASD行为表型的影响,并探讨潜在的调控机制,为nexmif缺失所致ASD运动障碍提供治疗靶点并为后续的药物筛查提供研究对象。第一部分 Nexmif基因在斑马鱼中的定位表达目的:明确斑马鱼中两个同源基因nexmifa及nexmifb的时空表达模式。方法:（1）收取受精后 36 小时（36 hours post-fertilization,36hpf）、48hpf、72hpf 及 96hpf野生型斑马鱼胚胎,整胚胎原位杂交（whole-mount in situ hybridization,WISH）技术检测以上时间点nexmifa及nexmifb的表达情况。（2）收取特异性标记运动神经元的Tg（mnx1:EGFP）品系和特异性标记内皮细胞的Tg（kdrl:EGFP）品系72hpf时间点胚胎,用流式细胞仪分选出两个品系的GFP阳性细胞,分别行逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测两组胚胎的nexmifa、nexmifb及运动神经元特异性表达基因mnx1的表达情况。结果:（1）nexmifa及nexmifb特异性表达于中枢神经系统,包括大脑及脊髓。自36hpf时,nexmifa及nexmifb已表达于中枢神经系统,随着胚胎发育,nexmifa及nexmifb的表达量渐增,48hpf时达高峰,后渐减少。（2）mnx1、nexmifa及nexmifb表达于标记运动神经元的Tg（mnx1:EGFP）品系上,而不表达于标记内皮细胞的Tg（kdrl:EGFP）品系上。结论:nexmifa及nexmifb定位表达于大脑及脊髓,且表达在运动神经元上。第二部分 Nexmif敲降导致脊髓运动神经元形态及行为学表型异常目的:利用反义吗啉环寡核苷酸（Morpholino,MO）技术建立nexmifa敲降及nexmifb敲降模型,从而人为的短时间调低nexmifa及nexmifb的基因表达水平。观察nexmifa敲降及nexmifb敲降对斑马鱼脊髓运动神经元形态的发生包括初级运动神经元（Primary motorneurons,PMNs）是否缺失、caudal primary（CaP）长度及每 1mm Cap上的分支数量的影响及对自由运动、旷场实验、明暗刺激实验、群集实验的行为学影响。方法:（1）根据nexmifa及nexmifb的序列特点设计分别用于敲降nexmifa及nexmifb基因的引物序列,送公司合成nexmifa MO及nexmifb MO试剂。在斑马鱼胚胎1-2细胞期分别注入 nexmifa MO 及 nexmifb MO 得到 nexmifa 敲降组（Nexmifa morphant）及 nexmifb 敲降组（Nexmifb morphant）斑马鱼。（2）体外构建工具质粒,将nexmifb MO序列结合位点插入带有EGFP报告基因的PCS2+质粒中,从而构建出带有nexmifb MO结合位点以及报告基因EGFP的PCS2+质粒。将构建好的质粒与nexmifb MO共注或单独注射于1-2期野生型AB品系斑马鱼胚胎,36hpf时共聚焦荧光显微镜下检测单独注射带有nexmifb MO结合位点以及报告基因EGFP的PCS2+质粒的斑马鱼及带有nexmifb MO结合位点以及报告基因EGFP的PCS2+质粒与nexmifb MO共注的斑马鱼是否有绿色荧光。（3）收集对照组（Ctrl）及nexmifa敲降组72hpf斑马鱼胚胎,RT-PCR法检测两组nexmifa的表达情况,并切下两组中的条带送公司测序。（4）定量 RT-PCR（quantitative RT-PCR,qRT-PCR）法检测对照组及 nexmifa 敲降组72hpf斑马鱼胚胎nexmifb的相对表达量,对照组及nexmifb敲降组72hpf斑马鱼胚胎nexmifa的相对表达量。（5）检测对照组、nexmifa敲降组及nexmifb敲降组斑马鱼48hpf及72hpf的孵化率及72hpf的鱼体体轴长度。（6）共聚焦荧光显微镜下观察对照组、nexmifa敲降组及nexmifb敲降组48hpf时间点及72hpf时间点脊髓运动神经元形态。（7）体外合成nexmifa mRNA及nexmifb mRNA从而构建nexmifa过表达及nexmifb过表达模型,共聚焦荧光显微镜下观察对照组、nexmifa敲降组、nexmifa敲降+mRNA组、nexmifb敲降组、nexmifb敲降+mRNA组48hpf时间点及72hpf时间点脊髓运动神经元形态。（8）收集48hpf对照组、nexmifa敲降组及nexmifb敲降组胚胎,用TUNEL试剂盒检测不同组凋亡情况。（9）采用诺达思公司的Danio Vision行为轨迹跟踪系统对对照组、nexmifa敲降组、nexmifa敲降+mRNA组、nexmifb敲降组、nexmifb敲降+mRNA组5dpf斑马鱼行自由运动、旷场实验、明暗刺激实验及群集实验。（10）收集24hpf及72hpf对照组、nexmifa敲降组及nexmifb敲降组胚胎,WISH法检测不同组肌肉相关基因myod1、myhz2、smyhc 1表达情况。结果:（1）RT-PCR提示野生对照组斑马鱼PCR产物仅在250bp附近出现一条条带,而nexmifa敲降组除250bp附近条带外,还产生了异常条带。送测结果提示nexmifa敲降组外显子2和外显子3之间插入了一段181bp的内含子2序列。（2）共聚焦下发现单独注射插入nexmifb MO序列的EGFP-PCS2+质粒斑马鱼36hpf时出现绿色荧光,而与nexmifb MO试剂共注的插入nexmifb MO序列的EGFP-PCS2+质粒斑马鱼36hpf时无绿色荧光。（3）qRT-PCR提示nexmifa敲降组的nexmifb相对表达水平较对照组无统计学差异（P＞0.05）,nexmifb敲降组的nexmifa相对表达水平较对照组无统计学差异（P＞0.05）。（4）72hpf nexmifa敲降组及nexmifb敲降组斑马鱼鱼体体轴较对照组短,差异有统计学意义（P＜0.01）。48hpf及72hpf时间点nexmifa敲降组及nexmifb敲降组斑马鱼胚胎孵化率均显著低于同时间点对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。（5）nexmifa敲降组及nexmifb敲降组斑马鱼48hpf时间点及72hpf时间点具有正常PMNs的胚胎比率、Caps长度及每1mm Caps上的分支数量均明显少于同时间点对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。（6）nexmifa敲降+mRNA组斑马鱼48hpf及72hpf时间点具有正常PMNs的斑马鱼胚胎率、Caps长度及每1mm Caps上的分支数量均大于同时间点nexmifa敲降组,小于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。（7）nexmifb敲降+mRNA组斑马鱼48hpf时具有正常PMNs的斑马鱼胚胎率大于nexmifb敲降组,小于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。nexmifb敲降+mRNA组斑马鱼48hpf及72hpf时Caps长度、每1mm Caps分支数量均大于同时间点nexmifb敲降组,小于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（8）48hpf时间点nexmifa敲降组及nexmifb敲降组斑马鱼脊髓运动神经元无明显凋亡信号出现。（9）5dpf时nexmifa敲降组斑马鱼30min游动距离、游动时平均速度较对照组少,在外周区游动的距离率、时间率较对照组少,差异均有统计学意义（P＜0.01）。nexmifa敲降+mRNA组30min游动距离、游动时平均速度较nexmifa敲降组多,在外周区游动的距离率、时间率较nexmifa敲降组大,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（10）5dpf时nexmifa敲降组斑马鱼任意两条鱼间平均距离较对照组大,差异有统计学意义（P＜0.01）。nexmifa敲降+mRNA组任意两条斑马鱼间平均距离较nexmifa敲降组小,差异有统计学意义（P＜0.05）。（11）明暗刺激实验中,不管是在光刺激还是黑暗情况下,5dpf时间点nexmifa敲降组斑马鱼每分钟游动距离均小于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。nexmifa敲降+mRNA组斑马鱼每分钟游动距离较nexmifa敲降组多,差异有统计学意义（P＜0.01）。nexmifa敲降组明暗转换瞬间的游动距离变化幅度较对照组少,nexmifa敲降+mRNA组变化幅度较nexmifa敲降组大。（12）5dpf时nexmifb敲降组斑马鱼30min游动距离、游动时平均速度较对照组少,在外周区游动的距离率、时间率较对照组少,差异均有统计学意义（P＜0.01）。nexmifb敲降+mRNA组30min游动距离、游动时平均速度较nexmifb敲降组多,在外周区游动的距离率、时间率较nexmifb敲降组长,差异有统计学意义（P＜0.05）。（13）5dpf时nexmifb敲降组斑马鱼任意两条鱼间平均距离较对照组大,差异有统计学意义（P＜0.01）。nexmifb敲降+mRNA组任意两条斑马鱼间平均距离较nexmifb敲降组小,差异有统计学意义（P＜0.05）。（14）明暗刺激实验中,不管是在光刺激还是黑暗情况下,5dpf时间点nexmifb敲降组斑马鱼每分钟游动距离均小于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。nexmifb敲降组明暗转换瞬间的游动距离变化幅度较对照组少,nexmifb敲降+mRNA组变化幅度较nexmifb敲降组大。（15）原位杂交提示对照组、nexmifa敲降组、nexmifb敲降组斑马鱼24hpfmyod1表达无区别,72hpf时间点myhz2、smyhc1表达也无区别。结论:（1）nexmifa及nexmifb基因的敲降均可导致脊髓运动神经元形态发生异常。（2）nexmifa及nexmifb基因的敲降所致的PMNs丢失并非由凋亡导致。（3）nexmifa及nexmifb基因的敲降均影响斑马鱼幼鱼自由运动能力、趋触性、对光线刺激的反应能力及社交距离。（4）nexmifa敲降及nexmifb敲降导致的自由运动障碍由脊髓运动神经元形态异常所致而非肌肉异常所致。第三部分 Nexmif敲除导致脊髓运动神经元形态及行为学表型异常目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建可稳定遗传的nexmif基因敲除突变模型。观察nexmif敲除对斑马鱼脊髓PMNs形态发育包括PMNs是否缺失,Caps长度及每1mm Caps上的分支数量的影响及对幼鱼自由运动、旷场实验、明暗刺激实验、群集实验,成鱼自由运动、旷场实验、群集实验、新缸实验及社交亲好实验的行为学影响。方法:（1）利用CRISPR/Cas9分别构建nexmifa、nexmifb敲除模型。（2）检测对照组、nexmif敲除突变体72hpf孵化率及鱼体体轴长度。（3）共聚焦荧光显微镜下观察对照组、nexmif敲除组48hpf时间点及72hpf时间点脊髓运动神经元形态。（4）TUNEL试剂盒检测对照组、nexmif敲除组凋亡情况。（5）采用诺达思公司的Danio Vision行为轨迹跟踪系统对7dpf对照组、nexmif敲除组斑马鱼行30min自由运动、旷场实验、明暗刺激实验及群集实验。（6）采用诺达思公司的Danio Vision行为轨迹跟踪系统对3月龄对照组、nexmif敲除组成鱼行10min自由运动、旷场实验、新缸实验、群集实验及社交偏好实验。（7）收集24hpf及72hpf对照组、nexmif敲除斑马鱼胚胎,WISH法检测myod1、myhz2、smyhc1 表达情况。结果:（1）Sanger测序提示nexmifa敲除突变体建立成功,系插入了 159bp的移码突变类型,nexmifb敲除突变体构建失败。（2）72hpf时间点nexmifa突变体组（Nexmifa mutant）孵化率及体轴长度较对照组少,差异均有统计学意义（P＜0.01）。（3）nexmifa敲除突变体斑马鱼48hpf及72hpf时间点具有正常PMNs的胚胎率、Caps长度及每1mm Caps分支数量均小于同时间点对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。（4）48hpf时间点nexmifa敲除组斑马鱼脊髓运动神经元无明显凋亡信号出现。（5）7dpf nexmifa敲除突变体斑马鱼30min平均每5分钟游动速度较对照组少,在外周区游动的距离率、时间率较对照组少,任意两条鱼间平均距离较对照组大,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（6）明暗刺激实验中,不管是在光刺激还是黑暗情况下,7dpf时间点nexmifa敲除突变体斑马鱼每分钟游动距离均小于对照组（P＜0.05）,明暗转换瞬间的游动距离变化幅度较对照组少。（7）3月龄nexmifa敲除突变体斑马鱼10min游动距离、游动时平均速度较对照组少,在外周区游动的距离率、时间率较对照组小,任意两条鱼间平均距离较对照组大,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（8）新缸实验中,3月龄nexmifa敲除突变体在底部时间率均较对照组少,在中间部时间率均较对照组多,差异均有统计学意义（P＜0.01）,在顶部的时间率与对照组无统计学差异（P＞0.05）。（9）社交偏好实验中,3月龄nexmifa敲除突变体斑马鱼在近社交区游动距离率及时间率较对照组少,差异均有统计学意义（P＜0.01）。（10）原位杂交提示nexmifa敲除突变体斑马鱼24hpf时间点myod1表达量、72hpf时间点myhz2、smyhc1表达量与对照组同时间点无差别。结论:（1）nexmifa基因敲除可导致脊髓运动神经元形态发生异常。（2）nexmifa基因敲除所致的PMNs丢失并非由于凋亡所致。（3）nexmifa基因敲除斑马鱼呈现出ASD表现。（4）nexmifa敲除导致的自由运动能力障碍由脊髓运动神经元形态异常所致而非肌肉异常所致。第四部分 Nexmif参与调控脊髓运动神经元形态的机制研究目的:利用转录组学寻找候选基因,探讨nexmif基因调节脊髓运动神经元形态发生及行为的机制。方法:（1）分别收集对照组、nexmifa敲降组及nexmifb敲降组72hpf胚胎,行转录组学测序。（2）qRT-PCR法检测对照组vs nexmifa敲降组与对照组vs nexmifb敲降组轴突导向通路上共同下调的的20个差异基因。（3）WISH 检测对照组 efna5b、sema6ba 及 ntn2 在 24hpf、48hpf 及 72hpf 时间点的表达情况。（4）共聚焦荧光显微镜下观察对照组、nexmifa敲除组、nexmifa敲除+efna5b mRNA 组、nexmifa 敲除+sema6ba mRNA 组、nexmifa 敲除+ntn2 mRNA 组 48hpf 时间点及72hpf时间点脊髓运动神经元形态。（5）共聚焦荧光显微镜下观察对照组、nexmifb敲降组、nexmifb敲降+efna5b mRNA 组、nexmifb 敲降+sema6ba mRNA 组、nexmifb 敲降+ntn2 mRNA 组 48hpf 时间点及72hpf时间点脊髓运动神经元形态。（6）培养 HEK293T 细胞,分别加入 Flag-nexmifa+Lipofectamine 2000、Flag-nexmifb+ Lipofectamine 2000、Myc-ntn2+Lipofectamine 2000、Flag-nexmifa+Myc-ntn2+Lipofectamine 2000、Flag-nexmifb+Myc-ntn2+Lipofectamine 2000,CoIP-WB 检测 Myc-ntn2分别与Flag-nexmifa及Flag-nexmifb间的结合作用。结果:（1）对照组vs nexmifa敲降组及对照组vs nexmifb敲降组中很多差异基因富集在神经相关的各种通路上（差异倍数＞2或＜0.5,P＜0.05）。对照组vs nexmifa敲降组与对照组vs nexmifb敲降组间有共同差异基因富集在轴突导向通路及各种突触通路上。其中轴突导向通路上有21个共同差异基因下调。（2）qRT-PCR提示20个轴突导向通路上共同下调的的差异基因中大多数变化趋势与转录组学一致,包括转录组中下调的efna5b、sema6ba及ntn2三个基因。（3）原位杂交发现efna5b、sema6ba及ntn2三个基因均主要表达在大脑及脊髓。（4）nexmifa 敲除+efna5b mRNA 组、nexmifa 敲除+sema6ba mRNA 组及 nexmifa敲除+ntn2 mRNA组48hpf时间点正常PMNs胚胎率、48hpf及72hpf时间点Caps长度、每1mm Caps分支数量均显著大于同时间点nexmifa敲除组,差异有统计学意义（P＜0.05）。（5）nexmifb 敲降+efna5b mRNA 组、nexmifb 敲降+sema6ba mRNA 组及 nexmifb敲降+ntn2mRNA组48hpf时间点正常PMNs胚胎率、48hpf及72hpf时间点Caps长度、每1mm Caps分支数量均显著大于同时间点nexmifb敲降组（P＜0.05）。（6）Flag-nexmifa 及 Flag-nexmifb 分别可与 Myc-ntn2 结合。结论:（1）本研究利用RNA-seq技术对Ctrl、nexmifa敲降及nexmifb敲降组测序,筛选出大量与本研究中观察到的异常脊髓运动神经元轴突形态表型一致的轴突导向通路差异基因,进一步肯定了 nexmif可以调节脊髓运动神经元轴突形态发生。（2）nexmifa敲降及敲除、nexmifb敲降后脊髓运动神经元轴突形态发生异常,轴突导向因子efna5b、sema6ba及ntn2下调,分别过表达efna5b、sema6ba及ntn2后能部分逆转nexmifa敲除及nexmifb敲降导致的异常脊髓运动神经元形态,揭示了nexmifa及nexmifb通过efna5b、sema6ba及ntn2三个不同家族的轴突导向因调节脊髓运动神经元发育期形态发生。（3）nexmifa及nexmifb可与ntn2直接结合从而调节脊髓运动神经元发育期形态发生。