目的课题组前期通过全转录测序分析结果得出CCR5与BPD的发病有关,CCR5主要表达于单核、巨噬细胞和淋巴细胞等,CCR5及其配体在细胞迁移中发挥了重要的作用,本研究主要探究CCR5在BPD的肺泡化阻滞过程中的作用及其作用机制。方法第一部分:收集BPD患儿外周静脉血,采用ELISA检测BPD患儿血清中CCR5配体CCL3、CCL4、CCL5的表达水平,流式细胞技术检测BPD人群样本单核细胞中CCR5的表达水平,探索CCR5在BPD中的有无异常;在动物实验中通过羊膜腔注射LPS构建动物BPD模型,收集出生后1、3、7天新生鼠肺组织,采用HE染色鉴定模型成功与否,Westerbloting测肺组织样本CCR5的蛋白表达,在新生大鼠BPD模型中羊膜腔注射DAPTA阻断CCR5的作用,观察肺组织BPD病理的有无得到改善,以确定CCR5在BPD中的作用。第二部分:在动物模型中采用免疫荧光分别标记大鼠肺泡巨噬细胞（F4/80）、IL-1β观察新生鼠BPD模型肺部IL-1β和巨噬细胞的变化,并免疫荧光双标肺组织F4/80、IL-1β探索IL-1β的来源;SD大鼠羊膜腔注射Saline、LPS、LPS+IL-1β中和抗体、IL-1β,在各个分组中检测肺组织LOX酶的活性和表达,以及相应分组下肺的HE染色、弹性蛋白染色,明确IL-1β引起肺泡化阻滞的原因;通过BPD动物模型中加入DAPTA（CCR5抑制剂）干预检测IL-1β的水平变化,探索IL-1β的分泌和CCR5的关系,以进一步明确CCR5与BPD的关系;在体外实验中采用Western Bloting测定LPS刺激后的RAW264.7细胞CCR5的表达,T ranswell观察LPS刺激后巨噬细胞迁移能力的改变,探索BPD肺部微环境中巨噬细胞的增多是否与CCR5介导的巨噬细胞迁移能力增加有关;通过原代细胞培养RIP3基因敲除的C57小鼠的骨髓巨噬细胞,探索CCR5与RIP3的关系,We stern Bloting分别检测加入RIP3刺激剂后的P-RIP3、P65的表达水平,探索RI P3是否通过NF-κB通路调控CCR5的表达,并且在骨髓原代巨噬细胞的培养中加入PDTC（CCR5抑制剂）验证NF-κB通路对CCR5的调控作用。第三部分:羊膜腔注射药LPS建立新生鼠支气管发育不良（BPD）动物模型,并通注射BTA干预,取第1、3、7天新生鼠肺组织,HE染色、间苯二酚染色观察肺泡化阻滞的改变;采用Real-time PCR和ELISA新生鼠肺组织中炎症因子IL-1βm RNA水平及蛋白量。体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,BTA干预LPS诱导的炎症反应,用Real-time PCR和ELISA检测各组IL-1βm RNA水平及蛋白量。结果第一部分:1)BPD患儿人群血清ELISA结果显示CCR5的配体CCL3、CCL4、CCL5均升高;2)流式细胞结果显示BPD患儿单核细胞中的CCR5表达较无BPD患儿高;3)CCR5在新生大鼠BPD模型中肺组织的表达第1、3、7天均比对照组高;在BPD动物模型中加入DAPTA干预后,BPD的病理改变得到改善。第二部分:1)BPD免疫荧光双标结果显示肺部微环境中IL-1β、巨噬细胞增多,并且IL-1β由巨噬细胞分泌;2)在Saline、LPS、LPS+IL-1β中和抗体、I L-1β分组肺组织中检测LOX酶的活性和表达,LPS、IL-1β组肺组织中LOX酶的表达及活性增加,弹性蛋白分布紊乱,加入IL-1β中和抗体抑制剂后得到改善;3)BPD模型肺组织中IL-1β表达增高,加入DATPA后IL-1β的表达下调;4)LPS刺激后巨噬细胞的迁移能力增强,并且这种增强的迁移能力能够被DAPTA所抑制;5)RIP3+/-基因敲除C57小鼠骨髓原代细胞培养及干预结果显示RIP3激活后CCR5表达增高,LPS通过激活RIP3引起CCR5表达增高,RIP3激活后可以激活P65,并且RIP3激活引起的CCR5表达增加在加入PDTC（NF-k B通路抑制剂）后CCR5表达降低。第三部分:新生鼠肺组织HE结果显示BTA干预组较LPS组第1、3、7天肺泡数量增多、次级突起数量增多、平均内衬间隔减小;肺组织经BTA干预后IL-1βm RNA表达及蛋白表达均较LPS组减少;体外实验结果显示RAW264.7细胞LPS刺激组IL-1βm RNA和蛋白均较Saline组增高,LPS+BTA组较LPS组IL-1βm RNA表达及蛋白表达量均减少。结论:BPD的发生与CCR5的表达增高有关,RIP3通过NF-k B通路上调C CR5的表达,表达增多的CCR5引起肺部巨噬细胞增多,并分泌的IL-1β。IL-1β通过作用于LOX的活性和表达作用于弹性蛋白的分布,引起肺泡化阻滞。