【摘 要】
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十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)是一种研究植物病原细菌与寄主植物互作的分子机理的模式菌,它能够感染甘蓝、白菜和萝卜等许多重要的十字花科作物引起黑腐病。研究表明,由rpf(regulator of pathogenicity factor)基因簇编码的Rpf/DSF群体感应系统(quorum sensing system
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十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)是一种研究植物病原细菌与寄主植物互作的分子机理的模式菌,它能够感染甘蓝、白菜和萝卜等许多重要的十字花科作物引起黑腐病。研究表明,由rpf(regulator of pathogenicity factor)基因簇编码的Rpf/DSF群体感应系统(quorum sensing system,QS)以及由hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)是Xcc最重要的两大致病系统。本课题的前期工作通过构建启动子-gus A报告系统研究了编码Rpf/DSF群体感应系统的信号分子(DSF)受体蛋白Rpf C的基因(rpf C)缺失对Ⅲ型分泌系统的两个关键调控基因hrp X和hrp G的表达的影响。结果发现,在基本培养基XCM1中,hrp X的表达受Rpf C正调控,但hrp G的表达不受Rpf C调控。本研究采用Western杂交检测方法,明确Hrp X和Hrp G蛋白的积累量是否受rpf C缺失的影响。本研究首先采用定量Western杂交检测方法,检测和比较了野生型菌株和rpf C缺失突变体中Hrp X的积累量。结果发现,在基本培养基MMX培养条件下,rpf C缺失突变体中Hrp X的积累量比在野生型菌株中低大约74%,说明Rpf C对Hrp X的积累有正向作用。更重要的是,Western杂交结果显示,在rpf C缺失突变体中,除了全长Hrp X的信号外,还存在一条分子量较小的信号带。本研究推测这条分子量较小的信号带是全长Hrp X的剪切加工产物,因此,说明rpf C的缺失触发了Hrp X的剪切加工。与在基本培养基MMX培养条件下的情况相似,在丰富培养基NYG培养条件下,rpf C缺失突变体中Hrp X的积累量同样比在野生型菌株中显著下降,但没有检测到剪切加工现象,说明rpf C缺失对Hrp X的影响因环境条件的不同而不同。Northern杂交结果显示,rpf C缺失突变体中hrp X的mRNA水平比在野生型菌株中显著下降。接着,本研究采用同样的方法检测和比较了野生型菌株和rpf C缺失突变体中Hrp G的积累量。结果发现,无论是在MMX或NYG培养条件下,rpf C缺失都会导致Hrp G积累量的显著下降,但下降幅度没有Hrp X的下降幅度大。出人意料的是,尽管rpf C缺失突变体中Hrp G的积累量比在野生型菌株中显著下降,但是,Northern杂交结果显示,rpf C缺失突变体和野生型菌株中hrp G的mRNA水平并没有差异,预示Rpf C可能通过影响hrp G mRNA的翻译或Hrp G的稳定性来影响Hrp G的积累。在此基础上,本研究使用Northern杂交检测了野生型菌株和rpf C缺失突变体以及rpf C回补菌株中由Hrp X正调控的hrp基因簇(hrp A～hrp F)mRNA积累量。结果发现在MMX培养基中rpf C缺失会导致hrp B、hrp C、hrp D和hrp F的mRNA积累量下调,实验结果预示Rpf C可能通过多种调控途经影响三型分泌系统。此外,本研究还对rpf C缺失对全局转录调控蛋白Clp的影响进行了初步的探索,结果发现,rpf C缺失不影响Clp的积累量。总之,本研究采用Western杂交方法,研究了Xcc编码Rpf/DSF群体感应系统的信号分子受体蛋白Rpf C的基因(rpf C)的缺失对Ⅲ型分泌系统的两个关键调控蛋白Hrp X和Hrp G的表达影响,发现了Hrp X的剪切加工现象,并证明Rpf C在Hrp X的剪切加工中发挥了重要作用。本研究对于进一步研究十字花科黑腐病菌的致病机理有重要意义。
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