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背景:缺氧是实体瘤肿瘤微环境的一大典型特征,实体瘤中的恶性肿瘤细胞增殖过快,局部新生血管和氧气供应无法满足其对生长和代谢的正常需求,加之实体瘤患者治疗过程中造成的贫血等原因,都可能会营造缺氧微环境。在缺氧条件下,恶性肿瘤细胞主要通过缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factors,HIFs)激活一系列适应性反应以维持自身存活。HIF由可诱导的α亚基和组成性表达的β亚基组成,而HIF-α稳定性主要受到泛素-蛋白酶体系统的调控,泛素连接酶VHL可以与羟基化的HIF-α相互作用,并诱导其发生泛素化降解。在肾透明细胞癌中,VHL突变率高达70%以上,突变种类和位点众多但患者预后却不尽相同。我们实验室前期工作证实去泛素化酶OTUD6B以非酶活依赖的方式与VHL复合体相互作用并稳定p VHL,从而拮抗VHL-HIF信号通路,抑制肝癌转移。尽管该研究证实了OTUD6B正向调控VHL蛋白的稳定性且在肝细胞癌中发挥抑癌功能,但是这一调节机制在肾透明细胞癌中是否依然发挥作用还尚未可知。肾透明细胞癌中VHL蛋白70%以上以突变型存在,肾癌患者转移后生存情况较差,其二者之间是否存在相关性?去泛素化酶OTUD6B是否通过调控肾透明细胞癌中VHL蛋白和VHL突变体的稳定性进而影响肾癌发生发展?我们都还尚未可知。VHL在肾透明细胞癌中突变位点众多,突变类型复杂,在此背景下该如何阐明上述问题也是我们在研究中不得不面对的挑战。本研究是对cc RCC发生发展机制的新的探索,试图从去泛素化酶的角度阐明该机制。同时,我们也揭示了OTUD6B调控cc RCC中VHL突变体的机制,扩展了OTUD6B功能的相关研究。目的:探究去泛素化酶OTUD6B在肾透明细胞癌细胞中是否调控p VHL稳定性进而影响肿瘤发展;探究OTUD6B对肾透明细胞癌细胞增殖和迁移能力的影响;OTUD6B对不同类型的VHL突变体是否具有功能。方法:1)利用TCGA数据库中TCGA-KIRC数据集分析cc RCC患者OTUD6B及VHL水平与肿瘤转移、分期和患者预后的关系。2)检测OTUD6B和VHL在cc RCC细胞中的基础表达;利用免疫沉淀实验检测肾透明细胞癌细胞系中OTUD6B和VHL的相互作用;构建OTUD6B敲低的cc RCC细胞系,利用蛋白质泛素化实验检测VHL泛素化水平的变化。3)在上述构建的OTUD6B敲低以及过表达的稳定株中,利用蛋白质免疫印迹法检测OTUD6B、p VHL、HIF-2α、E-cadherin和Slug蛋白水平的变化;利用Transwell迁移实验观察OTUD6B敲低和过表达对cc RCC细胞迁移能力的影响。4)在上述构建的OTUD6B敲低和过表达的稳定株中,利用蛋白质免疫印迹法检测相关细胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表达在蛋白水平上的变化;利用CCK8实验观察OTUD6B敲低和过表达对cc RCC细胞增殖能力的影响。5)构建p VHL的点突变体质粒,将点突变体和OTUD6B共转染入细胞后利用蛋白质免疫印迹法检测突变体蛋白水平和半衰期的变化;利用免疫沉淀和蛋白质免疫印迹法检测cc RCC中OTUD6B与p VHL突变体之间是否存在相互作用;利用泛素化实验检测OTUD6B能否影响p VHL突变体的泛素化水平。6)在OTUD6B敲低的移码突变型细胞系中瞬时转染p VHL突变体,蛋白质免疫印迹法检测OTUD6B、p VHL、HIF-2α、E-cadherin和Slug蛋白水平上的变化以及Transwell实验检测细胞迁移能力的变化。结果:1)针对TCGA数据库的分析发现OTUD6B和VHL表达水平高与cc RCC患者预后好正相关;并且该效应与cc RCC患者的VHL突变类型相关,只在错义突变组中有此关联性。2)VHL野生型肾透明细胞癌细胞系中OTUD6B和VHL存在相互作用以及OTUD6B减少VHL蛋白的泛素化水平。3)OTUD6B敲低上调HIF-2α和Slug蛋白水平,促进肾透明细胞癌细胞迁移;过表达OTUD6B则抑制肾癌细胞迁移。4)过表达或敲低OTUD6B对肾癌细胞增殖能力无明显影响。5)OTUD6B增加VHL突变体蛋白水平、延长其半衰期;与VHL突变体间依然存在相互作用,并减少其泛素化水平。6)OTUD6B敲低影响外源性VHL点突变体表达,促进cc RCC细胞迁移。结论:去泛素化酶OTUD6B稳定肾透明细胞癌细胞中的p VHL,下调其HIF-2α蛋白水平,抑制肿瘤进程;OTUD6B抑制肾透明细胞癌细胞迁移;OTUD6B依然对p VHL的部分错义突变体行使相同功能。