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油菜是我国重要的油料作物，它不仅是优质的食用油和动物饲料来源，也是工业原料和生物能源的重要来源。种子含油量和硫苷含量是油菜的两个重要品质性状。甘蓝型油菜含油量是一个由微效多基因控制且容易受环境影响的性状，目前对其遗传及调控的理解并不深入，能够用于改良含油量的QTL及其分子标记仍然非常有限。同时，由于油菜饼粕中的硫苷在动物体内的水解产物会对动物产生毒害作用，较低的种子硫苷含量是保证饼粕饲用价值的必然要求。虽然在同属于十字花科的模式生物拟南芥中，种子硫苷合成、调控和代谢的分子调控机制较为清晰，但在异源四倍体的甘蓝型油菜中，高度复制的同源基因功能的分化和保留并不清晰。同时，在较低的硫苷水平下(35-50μmol/g)，进一步降低硫苷含量仍是实际育种中的主要挑战之一。本研究以一个甘蓝型油菜DH群体为材料，对种子含油量和硫苷含量开展了QTL定位，并基本确定了其中一个硫苷主效QTLqGSL-C2的目标基因。具体研究结果如下：
1甘蓝型油菜遗传连锁图的构建。以低硫高含油量材料9172和较低硫低含油量材料G120为亲本构建包含169个DH系的遗传作图群体。对DH系和两个亲本进行RAD测序，共获得具有多态性的5477个SNP标记。剔除共分离的部分标记后，最终利用910个SNP标记和187个SSR标记构建一张甘蓝型油菜的遗传连锁图。该图谱包含19个连锁群，图谱总长2014.5cM，标记间平均图距1.87cM。
2甘蓝型油菜含油量和硫苷含量QTL初定位。在3年(2013、2014和2015)两个地点(武汉和荆州)下调查该群体各DH系及其双亲种子的含油量和硫苷含量，并进行全基因组QTL分析。对于含油量，共检测到3个QTL，分别位于染色体A5、A6和A10，其中qOIL-A5在15WH-2和15JZ-1两个重复中均被检测到，分别解释表型变异7.90%和7.10%；qOIL-A6在13JZ-1、13JZ-2和15WH-1三个重复中均被检测到，分别解释表型变异8.60%、7.60%和8.90%；qOIL-A10在14WH-1、15WH-2和15JZ-1三个重复中均被检测到，其分别解释表型变异6.70%、10.50%和6.90%。qOIL-A5和qOIL-A10增效等位基因来自于高含油量亲本9172，qOIL-A6增效等位基因来自于低含油量亲本G120。对于种子硫苷含量，则共检测到2个QTL，其中qGSL-C2是一个控制该群体硫苷变异的主效QTL，在所有的重复中均能稳定检测，其解释11.58%-72.87%的表型变异，加性效应为5.59-11.90μmol/g，增效等位基因来自于较低硫苷亲本G120。另一个QTLqGSL-A3则是一个微效QTL，能在4个重复中被检测到，解释群体2.43%-3.81%的表型变异，加性效应为1.58-2.13μmol/g，增效等位基因来自于低硫苷亲本9172。
3硫苷主效QTLqGSL-C2精细定位。以G120和9172分别为轮回亲本和供体亲本，构建qGSL-C2的近等基因系。以qGSL-C2候选区间在白菜A2上的同源序列作为参考序列，开发了10个SSR标记对候选区间进行标记加密。构建一个包含618个单株的BC4F1群体，将目标区间限定在了SSA2-90和SSA2-49两个SSR标记之间。该区段对应白菜A2染色体同源序列548kb的物理距离。为进一步缩小区间，构建了一个包含6000个单株的BC4F2群体，利用该群体中17个交换单株将qGSL-C2限定在了两个SSR标记SSA2-146和SSA2-157之间，对应白菜的A2染色体同源序列49kb，该区间有5个候选基因，其中Bra029311是拟南芥AtMYB28的同源基因。AtMYB28编码一个转录因子，对拟南芥脂肪族硫苷合成基因具有正调控作用。
4甘蓝型油菜qGSL-C2目标区段序列分析。由于甘蓝型油菜参考基因组在qGSL-C2目标区间的参考序列拼接不完整，遂根据白菜同源序列设计与目标QTL紧密连锁的引物对本实验室构建的混合型BAC克隆文库进行筛选，并成功获得包含9172基因型的BAC单克隆HBNB145D12和G120基因型的BAC单克隆HBNB78K4。将BAC克隆测序获得的序列，分别与白菜、甘蓝和甘蓝型油菜参考基因组进行序列比对。在甘蓝型油菜Darmor-bzh的参考序列中未找到与目标序列同源性很高的片段。HBNB78K4与甘蓝Scaffold000256具有良好的微共线性和72.1%的序列一致性，但与白菜中的A2染色体片段只有63.3%的序列一致性。HBNB145D12与白菜A2有77.9%的序列一致性，但与甘蓝Scaffold000256的序列一致性仅为53.9%。由此，我们推测BAC克隆虽然均来源于甘蓝型油菜C2染色体，但其祖先起源则不相同，其中HBNB78K4极可能来源于甘蓝C2染色体，而HBNB145D12则来源于白菜A2染色体。
5qGSL-C2候选基因BnaC2.MYB28的确定。根据BAC序列信息分析，候选基因区段同样包含一个与AtMYB28高度同源的候选基因。因此，该基因极可能是qGSL-C2的目标基因，被命名为BnaC2.MYB28。利用PCR从双亲中扩增到BnaC2.MYB28的等位基因序列，预测包含3个外显子和2个内含子，二者在启动子和编码序列区均存在多处变异，其中最显著的变异则是位于起始密码子ATG前575bp处的一个长达480bpInDel，且该基因在双亲中的序列多态性与BAC中该基因的差异一致。序列预测发现，双亲中编码的BnaC2.MYB28蛋白分别含有354个氨基酸和353个氨基酸，蛋白序列一致性达85.6%。
6低硫苷亲本9172中的BnaC2.MYB28等位基因可能起源于非同源染色体的交换(homeologous exchange，HE)。在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组数据库中分离MYB28同源基因，对MYB28进行进化树分析发现BnaC2.MYB28(G120)起源于甘蓝中的直系同源基因Bol007795，等位基因BnaC2.MYB28(9172)起源于白菜中的同源基因Bra029311。另外，用一个BnaC2.MYB28基因内的共显性标记对37份白菜和17份甘蓝DNA进行基因型分析发现白菜的基因型与9172一致，而甘蓝的基因型与G120一致。以上证据皆表明了BnaC2.MYB28(G120)起源于甘蓝，而BnaC2.MYB28(9172)起源于白菜，间接证明了BnaC2.MYB28等位基因的多态性是由于基因组内A2和C2染色体之间发生的区域性的homeologousexchange(HE)所致。
7BnaC2.MYB28影响自然群体中的种子硫苷含量变异。用BnaC2.MYB28基因内标记对454份甘蓝型油菜进行基因型分析，根据基因型分为三类：TypeA(G120型)、TypeB(9172型)和TypeC(9172×G120杂合型)。TypeA平均硫苷含量90.03±4.24μmol/g，TypeB平均硫苷含量38.02±0.99μmol/g，TypeC平均硫苷含量89.72±4.89μmol/g。TypeB与TypeA和TypeC硫苷含量存在显著性差异。该结果表明在自然群体中BnaC2.MYB28对种子硫苷含量有着重要的影响。
1甘蓝型油菜遗传连锁图的构建。以低硫高含油量材料9172和较低硫低含油量材料G120为亲本构建包含169个DH系的遗传作图群体。对DH系和两个亲本进行RAD测序，共获得具有多态性的5477个SNP标记。剔除共分离的部分标记后，最终利用910个SNP标记和187个SSR标记构建一张甘蓝型油菜的遗传连锁图。该图谱包含19个连锁群，图谱总长2014.5cM，标记间平均图距1.87cM。
2甘蓝型油菜含油量和硫苷含量QTL初定位。在3年(2013、2014和2015)两个地点(武汉和荆州)下调查该群体各DH系及其双亲种子的含油量和硫苷含量，并进行全基因组QTL分析。对于含油量，共检测到3个QTL，分别位于染色体A5、A6和A10，其中qOIL-A5在15WH-2和15JZ-1两个重复中均被检测到，分别解释表型变异7.90%和7.10%；qOIL-A6在13JZ-1、13JZ-2和15WH-1三个重复中均被检测到，分别解释表型变异8.60%、7.60%和8.90%；qOIL-A10在14WH-1、15WH-2和15JZ-1三个重复中均被检测到，其分别解释表型变异6.70%、10.50%和6.90%。qOIL-A5和qOIL-A10增效等位基因来自于高含油量亲本9172，qOIL-A6增效等位基因来自于低含油量亲本G120。对于种子硫苷含量，则共检测到2个QTL，其中qGSL-C2是一个控制该群体硫苷变异的主效QTL，在所有的重复中均能稳定检测，其解释11.58%-72.87%的表型变异，加性效应为5.59-11.90μmol/g，增效等位基因来自于较低硫苷亲本G120。另一个QTLqGSL-A3则是一个微效QTL，能在4个重复中被检测到，解释群体2.43%-3.81%的表型变异，加性效应为1.58-2.13μmol/g，增效等位基因来自于低硫苷亲本9172。
3硫苷主效QTLqGSL-C2精细定位。以G120和9172分别为轮回亲本和供体亲本，构建qGSL-C2的近等基因系。以qGSL-C2候选区间在白菜A2上的同源序列作为参考序列，开发了10个SSR标记对候选区间进行标记加密。构建一个包含618个单株的BC4F1群体，将目标区间限定在了SSA2-90和SSA2-49两个SSR标记之间。该区段对应白菜A2染色体同源序列548kb的物理距离。为进一步缩小区间，构建了一个包含6000个单株的BC4F2群体，利用该群体中17个交换单株将qGSL-C2限定在了两个SSR标记SSA2-146和SSA2-157之间，对应白菜的A2染色体同源序列49kb，该区间有5个候选基因，其中Bra029311是拟南芥AtMYB28的同源基因。AtMYB28编码一个转录因子，对拟南芥脂肪族硫苷合成基因具有正调控作用。
4甘蓝型油菜qGSL-C2目标区段序列分析。由于甘蓝型油菜参考基因组在qGSL-C2目标区间的参考序列拼接不完整，遂根据白菜同源序列设计与目标QTL紧密连锁的引物对本实验室构建的混合型BAC克隆文库进行筛选，并成功获得包含9172基因型的BAC单克隆HBNB145D12和G120基因型的BAC单克隆HBNB78K4。将BAC克隆测序获得的序列，分别与白菜、甘蓝和甘蓝型油菜参考基因组进行序列比对。在甘蓝型油菜Darmor-bzh的参考序列中未找到与目标序列同源性很高的片段。HBNB78K4与甘蓝Scaffold000256具有良好的微共线性和72.1%的序列一致性，但与白菜中的A2染色体片段只有63.3%的序列一致性。HBNB145D12与白菜A2有77.9%的序列一致性，但与甘蓝Scaffold000256的序列一致性仅为53.9%。由此，我们推测BAC克隆虽然均来源于甘蓝型油菜C2染色体，但其祖先起源则不相同，其中HBNB78K4极可能来源于甘蓝C2染色体，而HBNB145D12则来源于白菜A2染色体。
5qGSL-C2候选基因BnaC2.MYB28的确定。根据BAC序列信息分析，候选基因区段同样包含一个与AtMYB28高度同源的候选基因。因此，该基因极可能是qGSL-C2的目标基因，被命名为BnaC2.MYB28。利用PCR从双亲中扩增到BnaC2.MYB28的等位基因序列，预测包含3个外显子和2个内含子，二者在启动子和编码序列区均存在多处变异，其中最显著的变异则是位于起始密码子ATG前575bp处的一个长达480bpInDel，且该基因在双亲中的序列多态性与BAC中该基因的差异一致。序列预测发现，双亲中编码的BnaC2.MYB28蛋白分别含有354个氨基酸和353个氨基酸，蛋白序列一致性达85.6%。
6低硫苷亲本9172中的BnaC2.MYB28等位基因可能起源于非同源染色体的交换(homeologous exchange，HE)。在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组数据库中分离MYB28同源基因，对MYB28进行进化树分析发现BnaC2.MYB28(G120)起源于甘蓝中的直系同源基因Bol007795，等位基因BnaC2.MYB28(9172)起源于白菜中的同源基因Bra029311。另外，用一个BnaC2.MYB28基因内的共显性标记对37份白菜和17份甘蓝DNA进行基因型分析发现白菜的基因型与9172一致，而甘蓝的基因型与G120一致。以上证据皆表明了BnaC2.MYB28(G120)起源于甘蓝，而BnaC2.MYB28(9172)起源于白菜，间接证明了BnaC2.MYB28等位基因的多态性是由于基因组内A2和C2染色体之间发生的区域性的homeologousexchange(HE)所致。
7BnaC2.MYB28影响自然群体中的种子硫苷含量变异。用BnaC2.MYB28基因内标记对454份甘蓝型油菜进行基因型分析，根据基因型分为三类：TypeA(G120型)、TypeB(9172型)和TypeC(9172×G120杂合型)。TypeA平均硫苷含量90.03±4.24μmol/g，TypeB平均硫苷含量38.02±0.99μmol/g，TypeC平均硫苷含量89.72±4.89μmol/g。TypeB与TypeA和TypeC硫苷含量存在显著性差异。该结果表明在自然群体中BnaC2.MYB28对种子硫苷含量有着重要的影响。