研究目的本研究探讨优化新生脉散方对心肌肥厚大鼠心脏重塑过程中心肌结构的影响及相关作用靶点,阐明优化新生脉散方治疗心肌肥厚的药效及相关作用机制,为优化新生脉散方防治心肌肥厚、减少心肌纤维化、改善心室重构的作用提供实验依据。研究方法1.疾病-药物相关靶点的筛选。为探讨潜在作用机制,使用网络药理数据挖掘法选出心肌肥厚-优化新生脉散方交集靶点,制作优化新生脉散方药物-活性成分-交集靶点网络图,筛选出Focal adhesion通路上富集有PDGFRB,GSK3B,JUN,PRKCA,PIK3R1,RHOA,EGFR,PTK2,IGF1R,VEGFA R,AKT1,MAPK1,RAC1,RAF1,MET等相关靶点,在度值较高的靶点中,FAK、Rho A等属于Focal adhesion通路。选择性Src抑制剂PP2可显著降低FAK磷酸化,为验证优化新生脉散方及心肌肥厚对β1-integrin/FAK/ROCK/MLC信号通路的改变,我们选用PP2作为抑制剂组进行参照,选用β1-integrin、p-FAK、Rho GEF12、Rho A、ROCK1、ROCK2、p-MLC2、actin作为目的蛋白。2.模型的制造。本研究选取雄性SD大鼠220只,通过采用横主动脉弓缩窄法构建心肌肥厚大鼠模型200只。另有假手术组20只,仅暴露主动脉弓,不缩窄。造模后第11周进行超声心动图检测,根据超声结果评价模型是否成功,剔除不成模及死亡的大鼠,对余下108只心肌肥厚大鼠进行随机分组。将128只心肌肥厚大鼠分为7组,其中假手术组20只;心肌肥厚模型组、中药低、中、高剂量组、西药组和抑制剂组各18只。3.药物干预及取材。分组后进行连续4w的药物干预,其中抑制剂组提前3小时腹腔注射10mmol/L PP2,0.1m L/只。假手术组、模型组及抑制剂组予溶媒（0.5%CMC）灌胃;中药低、中、高剂量组分别以1.265g/kg、2.53g/kg、5.06g/kg优化新生脉散方进行灌胃;西药组予盐酸贝那普利灌胃,剂量为0.45mg/kg。定期称量体重,观察大鼠基本生长情况,并按照体重变化进行给药,每100g体重予1m L药液。干预4周后再次进行超声心动图的检测,记录体重,提取心脏组织并称重记录,组织分别冻存或泡入4%多聚甲醛固定。4.制作染色切片。制作HE染色切片:将多聚甲醛固定的心肌组织逐级脱水,将心脏在乳头肌水平横向一分为二,用石蜡包埋并切片,然后依次进行脱蜡、脱水及苏木精-伊红染色处理。明场显微镜镜下观察每组代表性心脏切片的心肌组织病理学改变。制作MASSON染色切片:将组织石蜡切片烤片2h后进行脱蜡处理,依次浸入MASSON A液,之后是MASSON B液与MASSON C液的混合液、MASSON D液、MASSON E液及MASSON F液中分别浸染,脱水、封片,明场显微镜下观察心肌结构及病理变化,采用Image J软件分析胶原蛋白体积分数。5.western blot法测定蛋白表达水平。等量提取大鼠左心心肌组织总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度、煮蛋白至蛋白变性呈链状,制备样品后进行SDS-PAGE电泳及转膜、封闭。依次孵育抗体,在暗室进行ECL化学发光法显色。洗涤过程均用PBST作为洗涤液,摇床匀速洗涤3-4次,v=50,每次10min。吸光度结果通过Image J软件进行量化,比较各组β1-integrin、p-FAK、Rho GEF12、Rho A、ROCK1、ROCK2、p-MLC2、actin蛋白的表达。研究结果1.优化新生脉散方对心肌肥厚大鼠心脏形态结构相关影响（1）大鼠心脏结构的变化。造模第11周超声显示,与假手术组相比,模型组大鼠呈现心肌肥厚状态:IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均有不同程度的增长,LVIDd及LVIDs有所降低。药物干预4周后超声显示,与模型组相比,各药物干预组各有不同改善:IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均有不同程度减低,LVIDd及LVIDs基本呈现增长态势,肥厚情况缓解。以上结果差别有统计学意义（p＜0.05）。（2）大鼠心肌肥厚指数的变化。与假手术组相比,模型组大鼠心脏质量指数（HMI、LVMI）均有所增加。与模型组相比,中药低、中、高剂量组、西药组及抑制剂组心脏质量指数（HMI、LVMI）均有不同程度的下降。以上差别有统计学意义（p＜0.05）。（3）大鼠心脏形态学的变化。模型组较假手术组心脏体积有所增大,各药物干预组较模型组心脏体积有不同程度的缩小。明视场显微镜下观察各组的HE染色切片发现,模型组切片的心肌结构较紊乱,纤维化显著增多。各药物干预组镜下仍有小范围的心肌细胞肥大,但心肌间质较模型组有所减少。镜下观察MASSON染色切片,模型组大鼠较假手术组心肌纤维排列紊乱,胶原蛋白体积分数远高于假手术组。与模型组相比,各药物干预组的心肌纤维排列有所改善,胶原蛋白体积分数有所降低（p＜0.05）,提示药物干预可以有效改善大鼠心肌纤维化。2.优化新生脉散方对心肌肥厚大鼠β1-integrin/FAK/ROCK/MLC信号通路上各蛋白表达水平的影响。与假手术组相比,模型组β1-integrin、p-FAK、Rho GEF12、Rho A、ROCK1、ROCK2、actin蛋白表达升高,p-MLC2蛋白表达下调。与模型组相比,中药低、中、高剂量组、西药组及抑制剂组β1-integrin、p-FAK、Rho GEF12、Rho A、ROCK1、ROCK2、actin蛋白表达相应有不同水平的下调,p-MLC2蛋白表达有所调高。以上结果差别有统计学意义（p＜0.05）。研究结论1.实验结果表明,优化新生脉散方可以改善甚至逆转大鼠心肌肥厚及心肌纤维化,FAK可能是其抑制心肌肥厚的重要靶点之一。2.我们初步探讨了优化新生脉散方防治心肌肥厚的作用机制,可能与其调节心肌肥厚大鼠β1integrin/FAK/ROCK/MLC信号通路有关。