细菌的众多生物学功能受到群体感应系统的调节与控制,抗生素虽然抑菌效果明显,却容易导致耐药性。研究表明,一些物质能够通过干扰群感系统来关闭病原菌的毒力表达,而不是单纯的限制细胞的生长,从而不会使致病菌显示出克服药物毒性、复杂的超感染和抗生素耐药性的性状。在革兰氏阴性菌中,高丝氨酸内酯AHL是调控群体感应系统的关键信号分子。群体感应淬灭酶AiiA酶是一种能够降解AHL的群体感应淬灭酶。研究群体感应的淬灭,开发高效的酶制剂是一种潜在预防细菌耐药性的有效方案。本研究以合成生物学手段,构建了一条能够高通量筛选高活性群体感应淬灭酶AiiA的基因线路,实现淬灭酶AiiA的定向进化;利用交错延伸技术作为体外重组手段,探究了延交错延伸的最佳反应条件,将基因线路筛选出的5个高活性AiiA突变菌株进行体外重组来获得杂合优良性状;通过酶活性测定和分子对接研究突变位点对AiiA酶活性的分子水平影响;通过改变基因线路中的元件实现对线路的优化,并在两种宿主细胞中进行的表征,分析了优化后通路。论文主要包括以下4个主要方面:第一,利用合成生物学手段构建基因线路高通量筛选能高效降解群体感应信号分子高丝氨酸内酯（AHL）的酶（AiiA酶）。研究结果表明:该基因线路在高浓度的信号分子存在下会启动受体细胞死亡,只有当受体细胞胞内能表达高活性的AiiA酶时才能存活下来。通过信号分子浓度梯度实验表明,该线路对信号分子（AHL,3-O-C6-（L）-HSL）的敏感浓度是100nM,在此浓度下,已经筛选到若干个突变子,包括115位、10位、14位、22位和191位。第二,使用StEP技术对5个AiiA突变子进行体外重组获得两个重组子（AA4:Asn22Asp 和 Pro46His 的双位点突变;AA63:Cys14Ser、Leu97Val 和 Ala115Arg的三位点突变）并对其酶活进行测定。得到交错延伸循环80次为最佳循环数,延伸温度60℃为最佳延伸温度。突变库中突变后酶活性增长倍数最高的是Pro10Ala,其相对比活力是4.84,其次是Aln22Asp的相对比活力是4.25。单点突变中Ala115Arg和Cys14Ser活性增长幅度较小,分别为2.98和2.89。双氨基酸突变AA4是酶活性最高的菌株,AA4是Asn22Asp和Pro46His的双位点突变,其比活力为5.96,相对于单点的Aln22Asp来说,仅提高了 1.71。而另一个多氨基酸突变AA63是Cys14Ser、Leu97Val和Ala115Arg的三位点突变,比活力结果为3.51,高出两单点突变的酶活力。第三,为了进一步探究突变对催化效率的影响,通过分子对接模拟分析了突变体与目标底物3-oxo-C6-HSL反应时的活性位点结合情况。Pro10Ala突变子中缩短的Oμ原子与Zn2距离在一定程度上可能促进了四面体的形成,稳定了酶与底物复合物;Aln22Asp的22号位Asp提高了酶稳定性;Asp191Gly内部活性机理暂时未知;Ala115Arg缩短的Cα-Zn1促进了亲核攻击;Cys14Ser内Tyr194-Oα之间氢键作用增强;AA4中46位点的贡献可能在于非极性的疏水区域;AA63中Cys14Ser突变子中氢键的强作用和Ala115Arg突变子的Ca与Zn1之间的加强作用都有很好的体现。第四,利用编码特异结合AHL的LuxR蛋白的基因luxr、既受LuxR-AHL复合物诱导又受LacI蛋白抑制的杂合启动子PluxI-lacO、编码细菌裂解蛋白Lysis的基因lysis以及编码野生型群体感应淬灭酶AiiA的基因aiiA,设计出可以筛选高活性的群体感应淬灭酶的基因线路:Pconst（17H）-RBS-luxR-TT-PluxI-lacO-RBS-lysis-TT-Pconst（17H）-RBS-aiiA-TT,使其既不会存在泄露导致lysis本底表达水平过高,又可以对AHL的响应更加灵敏,在低AHL浓度下也可以有较好的诱导效果。缓解了lysis本底表达水平过高所带来的线路不稳定的问题。