气相色谱-质谱联用技术测定人红细胞膜脂肪酸及OmegA-3指数及其临床应用研究

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人体内的脂肪酸根据其结构上的碳链是否含有双键分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸;饱和脂肪酸之间的区别在在于结构上碳氢链长度的不同,不饱和脂肪酸间的区别除了碳链长度不同外还有双键数目及位置的不同。不饱和脂肪酸碳链含有1个或1个以上的双键,根据双键数目将含有1个双键的称为单不饱和脂肪酸(monounsaturated fattyacids),将含有2个或2个以上双键的称作多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)。根据多不饱和脂肪酸碳链羧基端起最后一个双键相对于甲基碳(omega碳)原子的位置,将其分为omega-3系、omega-6系及omega-9系,其中最重要的是omega-3系和omega-6系PUFAs,二者是人体的必需脂肪酸,也是细胞膜磷脂的主要成分,人类自身不能合成omega-3和omega-6PUFAs,必须从食物中提供和补充。  Omega-3脂肪酸(也称ω-3脂肪酸或n-3脂肪酸)是含有18-22个碳原子的长链多不饱和脂肪酸,主要包括α-亚麻酸(Alpha-Linolenic acid,ALA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic,EPA)。在上个世纪80年代,丹麦科学家首先发现并报道了生活在北极地区的爱斯基摩人(因纽特人)的膳食以深海鱼类为主要来源而且饱和脂肪酸和胆固醇的含量较高,但人群冠心病的发病率却很低的现象。随后的研究发现富含omega-3PUFAs的饮食与心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的低风险具有相关性,而且可以显著降低冠心病的发病率和死亡率。随着研究的不断深入,omega-3PUFAs对人体的健康作用已涉及多个相关方面的研究及报道,包括心血管疾病、高血压、糖尿病、高脂血症及肥胖等多种代谢类疾病,同时在抗肿瘤、抗抑郁、炎症、促进大脑和视网膜发育以及促进骨骼健康等方面均发挥着积极作用。  人体内omega-3PUFAs的含量可以通过膳食摄入进行调节,但随着不同食物种类所包含的omega-3PUFAs的比例不同等储多影响因素,实际上很难精确的计算出通过膳食摄入的omega-3PUFAs的实际量,另外由于受机体内组织和细胞水平代谢状况的差异,因此需要一个客观的指标来衡量和判断omega-3PUFAs的含量和分布水平。Harris和Von Schacky于2004年首先提出了omega-3(ω-3或n-3)指数的概念,它是指红细胞膜中EPA和DHA两种脂肪酸占红细胞膜总脂肪酸中的百分比,它不受短时间内饮食的影响,反映的是人体较长时期内(1-2个月)膳食结构和体内脂肪酸营养的水平。已有大量的研究结果表明omega-3指数与冠状动脉性心脏病(Coronary heart disease,CHD)的危险性和死亡率呈显著负相关性,对临床评估冠心病具有较好的价值,现已成为一个新的冠状动脉性心脏病高危风险评估因素。当omega-3指数大于或等于8%时,对心血管疾病有预防作用,发病风险相对较低;当omega-3指数小于4%时,对心脏的保护作用较微弱,心血管疾病的发病风险较高,发生心脏猝死的风险是omega-3指数大于8%时的10倍。较高的omega-3指数(大于或等于8%)可以作为心血管疾病临床治疗的目标之一。  脂肪酸含量能够客观的反映人体内不同脂肪酸的营养水平,从而可为人体调整饮食结构提供客观的依据,增加不饱和脂肪酸的摄入,特别是omega-3脂肪酸的摄入比例,改变红细胞膜上脂肪酸的组成,以利于维护机体的健康。Omega-3PUFAs存在于甘油三酯、胆固醇酯、红细胞膜及各种脂肪组织中。目前,国内外流行病学调查和临床研究中有多种评价omega-3PUFAs的方法,如膳食摄入问卷调查、血浆磷脂脂肪酸谱、血浆胆固醇脂omega-3PUFAs指数和红细胞膜omega-3指数等。目前国内外普遍测定的是血清或血浆中的脂肪酸成分,其前处理方法主要是将脂肪酸进行硅烷衍生化或甲酯化反应,生成硅烷化产物或者甲酯化产物,检测方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)等方法。然而在红细胞膜脂肪酸的测定方法的相关研究比较少,且采用的检测方法主要是GC检测方法;目前,从生物体内分离出来的脂肪酸已有上百种,并且绝大部分脂肪酸的结构和性质非常的接近,如果仅使用GC进行分离检测,缺乏对样品中化合物成分的定性,极其容易出现对各组分定量不准确的情况。另一方面,因GC检测方法操作繁琐,而且完成一次检测需要较长的时间,难以适应快速检测和满足大范围的人群筛查的需要。因此,建立一种简便快速、灵敏度高、特异性强、准确性好的测定红细胞脂肪酸的方法显得尤为重要。  研究目的:  1.针对在目前脂肪酸测定分析方面存在的检测过程繁琐、定性定量不够准确检测通量小等多方面的不足,建立一种前处理过程操作简单、方法学稳定、灵敏度高、特异性强、准确性好、检测过程时间短、检测通量高且易于临床快速规模化应用的红细胞膜脂肪酸成分的检测方法。  2.应用新建立的红细胞脂肪酸检测方法,对健康体检人群和具有心血管疾病高危因素的原发性高血压人群进行红细胞脂肪酸成分测定及omega-3指数分析,了解和考察健康体检人群红细胞中各脂肪酸成分分布情况及omega-3指数水平的分布区间;比较不同组间人群红细胞脂肪酸分布水平的差异性。  研究方法:  1.将EDTA抗凝全血分离出的红细胞作为检测样本,在样本中加入脂肪酸内标和盐酸-甲醇进行甲酯化反应,然后使用正己烷进行液液萃取,转移萃取后的上层溶液,使用氮气吹干萃取溶液,加入正己烷重新溶解,将复溶液使用气相色谱-质谱联用仪进行检测。将待测样品中各种脂肪酸成分和标准品的相关参数与标准质谱谱库进行比对作为定性依据,用内标标准曲线法对红细胞膜中各脂肪酸的组分进行定量分析。从检测方法的准确度、精密度、线性范围、分析灵敏度、样品稳定性等多个方面对所建立的方法学进行评价。  2.收集广州地区149名健康体检者作为研究对象,应用上述建立的检测方法对研究对象进行红细胞脂肪酸成分测定及omega-3指数分析,了解和考察健康体检人群红细胞中各脂肪酸成分分布情况及omega-3指数水平的分布区间。  3.收集广州地区年龄介于40-60岁之间的29例健康人群和22例原发性高血压人群作为研究对象,采用上述所建立的气相色谱-质谱(GC-MS)方法测定和分析研究对象的红细胞脂肪酸成分分布并计算其omega-3指数水平等检测指标,然后对两组研究对象的红细胞脂肪酸分布情况等结果进行比较。  研究结果:  1.GC-MS检测红细胞脂肪酸的分析条件:①色谱分析条件:采用安捷伦DB-23毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.15um);不分流进样模式,进样体积1μL,色谱柱流量0.78mL/min;进样口温度:230℃;接口温度:250℃;起始柱温50℃,保持时间1min,然后以25℃/min的速率程序升温至175℃,再以4℃/min的速率程序升温到223℃,保持8min,然后以20℃/min速率升温到250℃,保持12min;②质谱分析条件:采用电子轰击式离子源(EI)模式,离子源温度:220℃;溶剂延迟时间10min;扫描模式:全扫描(scan)和选择离子扫描(SIM);全扫描范围:m/z60.00-450.00。所建立的方法能够很好的区分脂肪酸标准品和内标,整个检测分析时间在12分钟内完成,  2.方法:性能评价表明,本研究建立的红细胞膜脂肪酸检测方法的最低检出限达到0.01mg/L,检测灵敏度高;检测线性范围为0.02-407.04mg/L,检测线性良好;omega-3指数检测的批内和批间精密度均满足要求。与现有传统检测方法相比,应用本方法检测红细胞脂肪酸时间短,仪器检测通量高。  3.本研究中149例广州地区健康体检人群红细胞膜中20种单脂肪酸占总脂肪酸含量的百分比例在0.03%-22.44%之间,占比例最少的为C18∶3n6,含量最高的是C20∶4n6;总单不饱和脂肪酸的含量比例为19.29%,多不饱和脂肪酸的比例为22.09%;多不饱和脂肪酸中,omega-3系列占总脂肪酸含量的比例为7.24%,omega-6系列的占比为39.29%;红细胞omega-3指数的均值为5.82%,其95%的分布区间为3.59-8.44%。  4.健康人群与原发性高血压人群的C22∶5n3(P=0.018)、C20∶4n6(P=0.042)、总omega-6脂肪酸(P=0.028)、omega-6/omega-3(P=0.007)及AA/EPA(P=0.005)存在显著性差异,其他各项指标均未见明显差异。  研究结论:  1.建立了一种应用GC-MS方法测定红细胞膜中脂肪酸成分的检测方法,该方法前处理过程操作简单、方法学稳定、灵敏度高、特异性强、准确性好、检测过程时间短、检测通量高且易于临床快速检测及大规模筛查应用。  2.检测分析了广州地区149名健康体检人群红细胞脂肪酸成分分布和omega-3指数水平情况,给出了此群体红细胞中各脂肪酸成分特征和omega-3指数水平的分布区间。  3.原发性高血压人群红细胞中总Omega-6脂肪酸、Omega-6/Omega-3、AA/EPA均高于健康人群。
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