论文部分内容阅读
小麦芽含有丰富的酶系,其中内肽酶主要作用于蛋白质多肽链内部的肽键使蛋白质长链分解成短肽。在许多食品加工原料及食品加工过程,内肽酶活力的大小直接影响到底物蛋白、产物蛋白的含量及组成比例,同时也是很多发酵食品的重要监测指标。豆粕蛋白质含量高,分子质量大、结构紧密,消化利用率不高。通过酶法将大分子蛋白质降解成小分子蛋白质、肽和氨基酸,从而使蛋白质分子量降低,提高蛋白质的利用率。而小麦芽作为天然的复合酶,可以解决豆粕中所含的蛋白质分子质量较大、消化利用率相对较低等问题。本研究改进了小麦芽内肽酶活力测定方法,探索了小麦芽内肽酶的酶学性质和动力学常数,确定了最佳酶活力测定条件。将小麦芽内肽酶应用到豆粕降解中,研究了酶解时间对产物蛋白含量、氨基氮含量、蛋白质分子量大小分布等指标的影响规律,采用红外光谱、扫描电镜、拉曼光谱等技术手段明确了豆粕降解前后蛋白质的结构的变化。并对豆粕降解产物中抗氧化活性肽做了探讨。主要研究结果如下:(1)本实验在利用SDS-PAGE电泳技术观察反应产物条带分布的基础上,采用三氯乙酸沉淀反应体系中大分子蛋白质,留下产物肽,通过测定产物肽含量精确测定小麦芽内肽酶活性。实验结果中显示三氯乙酸(TCA)可以较好的沉淀大分子的蛋白质,实验精密度较好,小麦芽内肽酶活力的最佳测定条件为:反应时间为5h,酶添加量为20u。(2)小麦芽内肽酶的最适pH值为4,在T=50℃,pH=4的条件下保温60min酶活力稳定,而T=50℃,pH=4.5、5、5.5的条件下酶活力不稳定,随着保温时间的延长,酶活力大小呈现不同程度的降低;该酶最适反应温度为50℃,在40℃和50℃之间内肽酶活力稳定,60℃时内肽酶活力随着保温时间的延长不断降低;同时,Lineweaver Burk plot的线性拟合Km的测定值为6.247mM,说明酶与底物具有很强的亲和力;5mmoL/L的Ca2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、EDTA能明显抑制内肽酶的活性。(3)研究了小麦芽内肽酶对豆粕的酶解规律,8h降解效率最高:豆粕氨基酸态氮含量达到5.19mg/g;水溶蛋白(WSP)含量显著提高,达到23.85%;盐溶蛋白含量达到9.60%;醇溶、碱溶蛋白含量分别降低为6.27%、6.03%。SDS-PAGE电泳结果显示水溶蛋白条带变化最为明显,酶解8h和10h的水溶蛋白条带最多颜色最深,29.0kDa的较大分子盐溶性蛋白条带增加,较小分子条带减少;碱溶蛋白和醇溶蛋白条带都发生不同程度的减少。拉曼光谱结果显示二硫键振动模式变化为t-g-t模式,说明蛋白结构趋于稳定;红外光谱(FTIR)显示,豆粕经酶解后结构变化明显,尤其是蛋白质二级结构峰面积显著增加;扫描电镜(SEM)结果显示经酶解的豆粕蛋白表面均出现了不同程度的破裂,说明经过酶解之后蛋白质分子表面变化剧烈。(4)本实验采用酸提法和80%乙醇水抽提法两种不同方法进行处理经酶解的豆粕蛋白中大分子蛋白质,以获得豆粕多肽。结果表明,这两种方法对大分子蛋白质的沉淀作用无显著性差异;分子量为<3kDa的豆粕水解肽羟自由基清除率最高,铁还原能力最强,ABTS自由基清除能力最强。