目的：达沙替尼(Dasatinib)是临床用于治疗伊马替尼耐药的慢性粒性白血病(CML)的抗肿瘤药物,为第二代小分子酪氨酸激酶抑制剂,同时正处于非小细胞肺癌的Ⅱ期临床研究。但Dasatinib的肝脏毒性是其严重的不良反应之一,极大的限制了Dasatinib的临床应用,深入研究Dasatinib肝脏毒性的分子机制和干预靶点具有深远的意义。我们的前期研究发现Dasatinib在发挥抗肿瘤作用的同时,能引起肝脏细胞发生自噬。因此,本课题旨在研究自噬在Dasatinib肝脏毒性中的作用,进一步探索自噬发生的机制,并寻找可以保护Dasatinib诱导的肝脏毒性的小分子抑制剂,为Dasatinib肝脏毒性的保护提供实验依据,拓展其临床应用的广度和深度。方法：采用裸小鼠移植瘤模型、ICR小鼠模型、大鼠原代肝脏细胞和永生化的人肝脏细胞Chang Liver,确证Dasatinib在临床治疗剂量下诱导肝脏毒性的同时可以激活自噬,并探讨其对达沙替尼诱导的肝脏毒性的影响。(1)采用ICR小鼠模型,灌胃给予临床治疗CML剂量的Dasatinib30天后,通过检测血清中血液生化指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和HE染色法,研究Dasatinib引起的肝脏毒性。(2)采用A549裸小鼠移植瘤模型,灌胃给予临床治疗实体瘤剂量的Dasatinib,30天后从瘤重、肿瘤体积(TV)相对肿瘤体积(RTV)等方面评价Dasatinib的抗肿瘤效果。(3)检测Dasatinib给药后的血液生化指标ALT、AST和LDH的变化,并采用肝组织切片HE染色法,探索Dasatinib在发挥抗肿瘤药效时的肝脏毒性。(4)采用免疫透射电镜(TEM)、组织匀浆Western Blot法检测肝组织中的自噬。(5)体内给予营养剂与Dasatinib共同作用ICR小鼠,比较摄食量的变化,采用组织匀浆Western Blot、血液生化检测和肝组织切片HE染色探索自噬发生的来源。(6)体外选用大鼠原代肝脏细胞,给予Dasatinib不同浓度和不同作用时间的处理,运用AO染色法、MDC染色法和Western Blot法研究自噬在Dasatinib肝脏毒性中的发生,并选用Western Blot法在永生化人肝脏细胞Chang Liver中确证自噬的发生。(7)体内选用ICR小鼠,给予Dasatinib作用1到4周,每周处死4只,采用血液生化指标、HE染色和Western Blot法分析自噬与Dasatinib肝脏毒性出现的先后顺序。(8)体外选用大鼠原代肝脏细胞和永生化的人肝脏细胞Chang Liver,给予3-MA和Dasatinib共同作用细胞,采用PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡的变化,同时用Western Blot法检测细胞自噬和凋亡相关蛋白LC3II/I、c-PARP、c-caspase-3的变化。(9)运用小分子RNA干扰技术,沉默大鼠原代肝脏细胞中的自噬相关蛋白ATG-5,给予Dasatinib处理后24h,采用PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡的变化,并用Western Blot法检测自噬及凋亡相关蛋白LC3II/I、c-PARP、c-caspase-3的表达情况。(10)体内采用ICR小鼠模型,给予3-MA和Dasatinib联合给药,30天后比较各组小鼠体重和死亡情况,采用TEM观察肝组织自噬的变化,同时检测血液生化指标ALT、AST和LDH的变化,并选取肝组织切片HE染色法,研究抑制自噬对Dasatinib诱导的肝脏毒性的影响。采用大鼠原代肝脏细胞和永生化的人肝脏细胞Chang Liver,在体外探索自噬调控Dasatinib肝脏毒性的分子机制,并寻找干预靶点的小分子抑制剂。(1)采用大鼠原代肝脏细胞和永生化的人肝脏细胞Chang Liver,以Dasatinib作用细胞不同时间,检测细胞活性氧簇(ROS)的变化情况。(2)采用大鼠原代肝脏细胞和永生化的人肝脏细胞Chang Liver,作用Dasatinib不同时间,Western Blot法检测MAPK通路中JNK、ERK、p38及其磷酸化水平的变化。(3)运用小分子RNA干扰技术,沉默大鼠原代肝脏细胞中MAPK通路蛋白JNK、ERK的表达,给予Dasatinib处理后24h,PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western Blot法检测自噬及凋亡相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、c-caspase-3的表达情况。(4)运用小分子RNA干扰技术,沉默大鼠原代肝脏细胞和Chang Liver中MAPK通路蛋白p38的表达,给予不同浓度的Dasatinib作用24h后,PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western Blot法检测自噬及凋亡相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、 c-caspase-3的表达情况。(5)采用AO染色、MDC染色法,检测p38激动剂异丙肾上腺素(ISO)与Dasatinib合用后大鼠原代肝脏细胞自噬的变化情况。(6)采用PI染色结合流式细胞术检测盐酸异丙肾上腺素(ISO)对Dasatinib诱导的大鼠原代肝脏细胞和Chang Liver细胞凋亡的影响。(7)采用Western Blot法检测ISO对Dasatinib引起的大鼠原代肝脏细胞和Chang Liver细胞自噬和凋亡蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、c-caspase-3及p-p38变化的影响。采用ICR小鼠研究盐酸异丙肾上腺素(ISO)在体内对Dasatinib肝脏毒性的保护作用；同时采用人非小细胞肺癌A549、前列腺癌PC3、乳腺癌MDA-MB-231、和A549裸小鼠移植瘤模型,研究ISO对Dasatinib抗肿瘤作用的影响。(1)采用ICR小鼠,灌胃给以Dasatinib和腹腔注射ISO联合给药30天,观察小鼠体重、血液生化指标的变化,HE染色观察肝脏组织损伤,研究ISO在体内对Dasatinib肝脏毒性的影响。采用Western Blot法检测小鼠肝脏中ISO对Dasatinib引起的凋亡蛋白c-PARP及c-caspase-3变化的影响。(2)采用Western Blot法检测小鼠肝脏中ISO对Dasatinib引起的自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ及p-p38变化的影响。(3)采用TEM观察ISO在体内对Dasatinib引起自噬的影响。(4)选取A549、PC3、MDA-MB-231三株肿瘤细胞,给予保护浓度的ISO和Dasatinib作用细胞24h,PI染色结合流式细胞术检测ISO在体外对Dasatinib抗肿瘤作用的影响。(5)采用A549非小细胞肺癌裸小鼠移植瘤模型,灌胃给以Dasatinib和腹腔注射ISO联合给药30天,通过检测瘤重、瘤体积、相对肿瘤体积,观察ISO在体内对Dasatinib抗肿瘤作用的影响。结果：1) Dasatinib在临床治疗剂量下诱导肝脏毒性的同时可以激活自噬,抑制自噬可以增强Dasatinib引起的肝脏毒性Dasatinib25mg/kg灌胃给药ICR小鼠30天后,与临床报道一致的引起肝脏功能紊乱。Dasatinib50mg/kg灌胃给药A549移植瘤裸小鼠30天后,与对照组相比,Dasatinib给药组明显抑制肿瘤生长,抑瘤率为55.9%,但Dasatinib给药组的小鼠体重明显下降,同时,血清中的肝酶ALT、AST、LDH含量是对照组的2-3倍,肝脏切片HE染色结果发现Dasatinib引起多个区域的炎性反应,表明Dasatinib在发挥抗肿瘤活性的同时有明显的肝脏毒性。采用组织电镜检测到Dasatinib组裸小鼠肝脏组织自噬泡的存在,Western Blot结果显示Dasatinib组裸小鼠肝脏组织自噬标记蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换明显增加。另外,ICR小鼠给予Dasatinib30天,给药期间给药组与对照组小鼠平均摄食量没有变化；给予营养剂和Dasatinib组的小鼠肝脏组织与未给予营养剂相比,仍有相同程度的LC3Ⅰ型向Ⅱ型转换和血清生化指标的升高,HE染色观察肝脏组织发现给予营养剂并不能逆转Dasatinib诱导的肝组织损伤,表明肝脏中自噬的激活是Dasatinib诱导的,而不是营养缺乏所致。采用AO和MDC染色法检测大鼠原代肝脏细胞内自噬泡的产生和分布情况,结果表明,随着Dasatinib作用时间和作用浓度的增加,标记酸性囊泡的红色荧光和示踪自噬泡的点状荧光均逐渐增加,呈浓度和时间依赖性。Western Blot确证了自噬标记蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换以及自噬底物蛋白p62的大量降解,表明Dasatinib在给药后的组织和细胞中诱导自噬的发生。体内ICR小鼠不同时间的血清及肝脏组织结果显示,Dasatinib肝脏毒性出现在给药第三周,而自噬出现在给药第四周。体外肝细胞中2mM的3-MA与12.5μM的Dasatinib共同作用24h,与Dasatinib单用组相比有明显的细胞凋亡率,同时伴随着凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3的明显增加。沉默大鼠原代肝细胞中ATG-5表达可以增加Dasatinib凋亡率和凋亡蛋白的表达；体内ICR小鼠给予2mg/kg的3-MA和50mg/kg的Dasatinib组给药30天后体重明显低于Dasatinib单用组,同时有2只(n=6)小鼠死亡(其他各组无死亡),合用组血液生化指标ALT、AST、LDH明显高于Dasatinib单用组,并且肝脏组织切片HE染色显示出更强的损伤,说明抑制自噬可以增强Dasatinib的肝脏毒性。2) Dasatinib引起的自噬是由p38-MAPK所介导的,小分子p38激动剂盐酸异丙肾上腺素(ISO)可以通过激活p38介导的自噬保护Dasatinib的肝脏毒性。流式细胞术检测ROS显示在Dasatinib作用0-7h的过程中,细胞中的ROS含量逐渐增高,并于7h达到最大。Western Blot结果显示,Dasatinib作用后细胞中JNK、ERK、p38的磷酸化水平增强。用小分子RNA干扰技术将MAPK通路JNK、 ERK沉默后,发现Dasatinib诱导的细胞凋亡及凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3明显减少,但对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例没有影响。用小分子RNA干扰技术将MAPK通路p38沉默后,发现随着Dasatinib给药浓度的增加,其诱导的细胞凋亡及凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3逐渐增加,同时自噬关键蛋白LC3II/I的比例逐渐降低。AO、MDC染色结果显示,10nM的ISO可以明显增加Dasatinib引起的酸性囊泡。PI流式细胞术结果显示,原代肝细胞的凋亡率由Dasatinib单用组的48.0%减少到了ISO与Dasatinib合用组的26.0%；Chang liver细胞的凋亡率由单用组46.0%的减少到了合用组的26.0%。同时,Western Blot结果显示,合用组ISO的自噬标记蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例明显增加,而凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3明显减少。这说明ISO在体外肝脏细胞中可以通过激活p38介导的自噬,保护Dasatinib的肝脏毒性。3)ISO可以在体内明显保护Dasatinib诱导的肝脏毒性,同时在体内外不影响Dasatinib的抗肿瘤活性体内ICR小鼠结果显示,ISO8ng/kg与Dasatinib50mg/kg合用组可以明显回调Dasatinib50mg/kg单用组引起的小鼠体重减轻,同时也降低Dasatinib累积的血清ALT、AST和LDH的升高；HE染色结果显示ISO可以明显减轻Dasatinib引起的小叶中心坏死、弥漫性肝变性和慢性多灶点炎症。同时,Western Blot结果显示,ISO在小鼠肝脏中可以明显降低Dasatinib引起的凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3的表达。进一步的,TEM和Western blot的结果确证了,ISO在小鼠肝脏细胞中可以明显增强Dasatinib诱导的自噬。在体外三株肿瘤细胞A549、PC3、MDA-MB-231中,10nM的ISO与10μM的Dasatinib合用不会降低Dasatinib的抗肿瘤活性。同时在体内A549裸小鼠移植瘤模型中,8ng/kg的ISO不影响50mg/kg的Dasatinib的抗肿瘤作用。说明ISO在保护Dasatinib引起的肝脏毒性的同时,不会影响其抗肿瘤效果。结论：本课题揭示了Dasatinib在发挥抗肿瘤作用的同时具有明显的肝脏损伤,而通过p38介导的保护性自噬可以对抗Dasatinib诱导的肝脏毒性,阐明了Dasatinib肝损伤的新机制。同时,盐酸异丙肾上腺素(ISO)可以在不影响Dasatinib抗肿瘤作用的同时明显改善Dasatinib诱导的肝脏功能下降,为临床Dasatinib的广泛应用及其肝脏毒性的防治提供了新颖的、可行的理论基础。