论文部分内容阅读
桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是隶属于双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae的世界性农业害虫。目前,由于长期、大量、不科学地使用化学杀虫剂,桔小实蝇对多种常用杀虫剂产生了不同程度的抗药性。以往的研究工作主要关注桔小实蝇的抗药性机理及其治理,近年来研究者逐渐将研究重点转向桔小实蝇新型药剂作用靶标的挖掘等领域。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是生物体绝大多数细胞中广泛存在的一种酶,主要催化谷氨酰胺的合成,参与调节细胞生长、能量代谢、蛋白质与核酸合成以及免疫应答。本学位论文对桔小实蝇两种谷氨酰胺合成酶同工酶基因BdGSs进行功能研究,为揭示桔小实蝇BdGSs参与幼虫生长发育及成虫生殖力调控功能的分子机制奠定基础,同时为使用RNAi技术防治桔小实蝇提供新型候选基因。本学位论文主要结果如下:1桔小实蝇BdGSs的cDNA克隆及系统发育分析采用PCR技术,克隆获得桔小实蝇线粒体GS(BdGS-m)和细胞质GS(BdGS-c)基因的cDNA序列。基于氨基酸序列的同源性分析结果显示,桔小实蝇BdGS-m与铜绿蝇LcGS-m的相似性高达82%,与黑腹果蝇DmGS-m的相似性高达80%。桔小实蝇BdGS-c与铜绿蝇LcGS-c和黑腹果蝇DmGS-c的相似性均高达90%。多序列比对结果显示,桔小实蝇两种亚型的GS氨基酸序列均含有5个保守结构域。基于BdGSs编码的氨基酸序列,预测桔小实蝇GS蛋白为无跨膜结构域与信号肽的亲水性蛋白。2桔小实蝇BdGSs时空表达模式分析采用RT-qPCR技术,解析桔小实蝇2种同工酶基因BdGS-m和BdGS-c在不同发育时期的表达模式。结果显示,BdGS-m在卵及成虫期相对表达量较高,BdGS-c在幼虫及成虫期相对表达量较高。桔小实蝇2种同工酶基因均在成虫期有较高的相对表达量,说明这2种同工酶均可能参与调控桔小实蝇成虫的生长发育及繁殖。BdGS-c在幼虫期表达量高于BdGS-m,且随虫龄增长表达量逐渐升高,说明BdGS-c可能对幼虫生长发育的调控起主导作用,BdGS-m则可能参与调控桔小实蝇胚胎的早期发育。分析桔小实蝇2种同工酶基因BdGS-m和BdGS-c在幼虫不同组织的表达模式,结果显示,BdGS-m在马氏管具有较高的表达量,而BdGS-c在中肠、脂肪体以及马氏管的表达量没有明显差异。在马氏管表达的BdGSs可能参与调控马氏管代谢物质的分泌,在中肠和脂肪体表达的BdGSs则可能通过不同的代谢途径去除机体中过量的铵离子与有毒物质,在中肠表达的BdGSs可能还参与围食膜的形成。分析2种同工酶基因BdGS-m和BdGS-c在成虫不同组织的表达模式,结果显示,BdGS-m在脂肪体有较高的表达量,可能参与氨代谢与卵黄原蛋白的合成以调节成虫生殖力,而在头部表达的BdGSs可能参与调节神经系统的修复、再生和免疫应答。3桔小实蝇BdGSs对环境胁迫的响应桔小实蝇幼虫受到高温、UV-B以及药剂胁迫后,其体内BdGS-m和BdGS-c的表达量均显著上调。由于极端温度、UV-B与杀虫剂均能引起桔小实蝇体内活性氧的大量积累,因此推测桔小实蝇BdGSs参与调节抗氧化作用。值得注意的是,桔小实蝇幼虫经低温处理后其体内BdGSs的表达量未发生显著变化,可能是由于在低温条件下,幼虫体内氨代谢速率与活性氧积累速率降低,因此BdGSs的表达量短时间内无明显差异。4桔小实蝇BdGSs参与幼虫生长发育过程桔小实蝇2日龄幼虫连续取食5 d含有专性抑制剂的人工饲料后,虫体较对照明显偏小、化蛹率显著降低、蛹重减轻、化蛹延迟、羽化率降低,且幼虫体内GS酶活性降低。推测是由于血淋巴中铵离子含量过高,对虫体产生毒害从而影响幼虫的生长发育。采用RNAi技术,将靶向BdGS-c的外源dsRNA注射入桔小实蝇幼虫体内,使BdGS-c表达受抑制后,幼虫发育历期延长、蛹重减轻。推测干扰BdGS-c可能引起幼虫氨代谢受阻,马氏管内的代谢物质不能正常分泌从而影响幼虫的生长发育。桔小实蝇幼虫体内Halloween基因家族关键基因BdSpook的表达量在干扰BdGS-c 24 h后显著下调,推测GS也可以通过影响蜕皮激素的合成影响幼虫的生长发育。GS对桔小实蝇幼虫生长速率、蛹化及羽化的影响为挖掘新型药剂作用靶标提供了理论基础。5桔小实蝇BdGSs参与成虫生殖力调控采用RNAi技术,分别将靶向2种BdGSs的外源dsRNA注射进入雌成虫体内,在mRNA水平有效抑制BdGSs基因的表达。观察桔小实蝇雌虫卵巢发育程度及产卵量发现,桔小实蝇雌成虫体内BdGSs表达水平下调后,产卵量显著减少,且卵巢直径偏小,推测桔小实蝇BdGS-m和BdGS-c均参与调控雌虫的生殖力。